Extraccion Liquido-liquido

INFORME DE LABORATORIO Nº 2:

“UNIDAD CROMATOGRAFÍA”

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC):

APLICACIONES:

“DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA EN DISTINTOS COMPUESTOS, MEDIANTE CURVA DE CALIBRACIÓN ABSOLUTA”.

Nombre: Lucero Paredes R. Carrera: Química ambiental.

Profesora: Sylvia Copaja.

Ayudante: Elisa Villarroel.

Fecha entrega: 22 de Junio del 2007.

INTRODUCCIÓN

La Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), se ha convertido en la técnica más popular y versátil de las técnicas analíticas modernas en los laboratorios actualmente.

Los sistemas de HPLC se utilizan hoy en día en una amplia variedad de campos, ya que día a día los exigencias de confiabilidad de los datos analíticos y de la eficiencia en el flujo de trabajo del laboratorio aumentan, esto es para un desarrollo más rápido de nuevas drogas, para mejorar la seguridad de los alimentos, y para cumplir con estándares más altos en regulaciones ambientales, para lo cual un laboratorio debe estar acondicionado con diversos detectores.

En este práctico se realizarán aplicaciones de esta técnica, como la cuantificación de distintos alimentos (como té, café, bebidas cola, etc.), donde se determinará la cantidad de cafeína que posee cada uno de ellos.

La cuantificación de compuestos de HPLC se hace mediante el proceso para determinar una concentración desconocida de un compuesto en una solución conocida. Esto implica inyectar una serie de concentraciones conocidas de la solución estándar en el HPLC para su detección. El cromatograma de estas concentraciones conocidas dará una serie de picos que se correlacionan con la concentración del compuesto inyectado, es decir, las áreas de cada estándar, tendrá una relación lineal con la concentración de éste, lo que origina una curva de calibración absoluta. Luego se toma el cromatograma a las muestras desconocidas, y de acuerdo al área que estos tengan, será su concentración.

La cafeína es determinada por HPLC utilizando fase inversa una columna de octadecilsilano (C18) con una mezcla metanol agua como fase móvil.

Objetivos:

- Construir una curva de calibración absoluta para cafeína.

- Determinar el contenido de cafeína en té, café y bebidas cola.

Ecuaciones utilizadas:

- Ecuación de disolución:

(1)

Donde:

C1= concentración inicial.

V1= alícuota usada.

C2= concentración final.

V2= volumen total.

- Ecuación para obtener la masa inyectada, considerando loop de 20 µL.

(2)

- Ecuación de la regresión lineal para la curva de calibración:

(3)

Donde.

Y= área de la señal.

b= sensibilidad del método, pendiente.

X= concentración (masa) del analito a evaluar.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. Materiales.

- Bomba HPLC Waters 1525.

- Detector UV-VIS de arreglo de diodos Waters 2996.

- Registrador y almacenador de datos (Computador).

- Agua de grado HPLC.

- Metanol de grado HPLC.

- Solución de Cafeína 0,01 µg/µL.

- 200 mL de Té.

- 200 mL de Café.

- 350 mL de Coca-cola.

- 350 mL de Coca-cola Light.

- Agua desionizada.

- Matraces de aforo de 10ml y 25mL.

- Jeringas de 5 mL.

- Filtros, de membrana de 0,45µm.

- Vasos de ependorf.

- Vasos precipitados de 10 mL.

- Microjeringa.

- Micropipeta.

2. Metodología.

- Para obtener la curva de calibración absoluta, se preparan los estándares a partir de una solución preparada de cafeína 0,1 µg/µL, se toma 1 mL de esta solución (llamada solución 1), y se afora a 10 mL con fase móvil, esta es la solución 2.

- A partir de la solución 2, se preparan una serie de estándares en los vasos ependorf, de acuerdo a:

a. 100 µL de solución 2 + 900 µL de fase móvil

b. 200 µL de solución 2 + 800 µL de fase móvil

c. 400 µL de solución 2 + 600 µL de fase móvil

d. 500 µL de solución 2 + 500 µL de fase móvil

e. 600 µL de solución 2 + 400 µL de fase móvil

f. 700 µL de solución 2 + 300 µL de fase móvil

g. 800 µL de solución 2 + 200 µL de fase móvil

h. 900 µL de solución 2 + 100 µL de fase móvil

- Luego de tener estas soluciones preparadas, con una microjeringa, agregar los estándares al inyector del equipo de HPLC.

- Este equipo debe estar bajo las siguientes condiciones:

a. Fase móvil: MeOH/Agua 40:60.

b. Velocidad de flujo de la fase móvil. 1Ml/min.

c. Detector a 254nm.

d. Columna Lichrosfer RP-100, C18.

- Se registran los cromatogramas de cada estándar, obteniendo el área, que luego se usará para construir la curva.

- Ahora para la preparación de las muestras, se toma una bolsita de té, y se deja en un vaso precipitado, agregando 200 mL de agua hervida y caliente.

- Para la preparación del café, se toma una cucharadita de café y se agrega a un vaso precipitado con 200 mL de agua caliente.

- Para las bebidas cola (coca-cola normal y coca-cola Light), se toman aprox. 5 mL y se desgasifican, agitando vigorosamente.

- Para todas las muestras, se toman 5 mL y se pasan a través de un filtro de membrana de 0,45µm, con una jeringa, para eliminar las impurezas.

- Para cada muestra, se toma 1mL del filtrado y se afora a 25 mL con agua desionizada.

- Luego, de estas muestras diluidas, se agregan a los vasos ependorf, y se inyectan al cromatógrafo para la obtención de cromatogramas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

- Para la preparación de estándares:

Las concentraciones se prepararon como lo indica la metodología,

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