Extracción de RNA

CUESTIONARIO

¿Cuáles son los tres tipos de RNA que se encuentran en las células eucariotas, que características y funciones presentan?

RNAm (RNA mensajero): Es quien lleva la información del núcleo al citoplasma para sintetizar las cadenas peptídicas. Codifica la secuencia de aminoácidos de uno o más polipéptidos especificados por un gen o por un conjunto de genes. De este modo, los ARN mensajeros han copiado una secuencia de ADN a nivel de cada gen. Cada molécula de ARN mensajero se unirá a un ribosoma. El ribosoma se deslizará a lo largo del mensajero dando lugar a la cadena de proteínas. Los codones se leen (traducen) en un sitio específico del ribosoma. Un aminoacil-tRNA se combina a través de su anticodón con el triplete mensajero. A medida que el ribosoma se desplaza, los diferentes aminoacil-t-ARN se unen sucesivamente a los tripletes de ARN y los aminoácidos se combinan entre sí, lo que permite la formación de la proteína. La parte codificante del ARN mensajero siempre termina con uno de los tres codones de «fin de síntesis».

ARNr (ARN ribosomal o ribosómico): Están relacionados con la síntesis de proteínas. Forman parte de los ribosomas que son las complejas maquinarias celulares que sintetizan las proteínas. Son los más abundantes de los ARN. Están involucrados en la estructura de los ribosomas y juegan un papel en la unión de los ARN mensajeros.

ARNt (ARN de transferencia): Se une al ARNm en función de la complementariedad de las bases de anticodón/codón. Su función es unir o enlazar aminoácidos y transportarlos hacia los ARNm para poder sintetizar las proteínas. Lee la información codificada en el ARN mensajero y transfiere el aminoácido adecuado a la cadena polipeptídica en crecimiento durante la síntesis proteica. Cada ARN de transferencia se combina con un aminoácido utilizando una enzima, aminoacil-ARNt sintetasa. Existe una especificidad estricta de cada enzima y cada ARNt para un aminoácido. El anticodón del t-RNA permite que el t-aminoacil-tRNA se combine con el triplete característico del aminoácido. Por tanto, los T-RNA son intermediarios obligatorios entre los aminoácidos y el RNA mensajero.

Comente sobre la ventaja del método de extracción de RNA con Trizol en relación a otros métodos.

El reactivo TRIzol mantiene la integridad del ARN gracias a la inhibición altamente eficaz de la actividad de ARNasa, al tiempo que destruye las células y disuelve los componentes celulares durante la homogeneización de muestras.

Mencione tres inhibidores de RNasas e indique cómo actúan.

La proteinasa K: Posee en su centro catalítico activo un aminoácido serina y tiene la función de romper los enlaces peptídicos por hidrólisis. A su vez esta enzima pertenece a la familia de las proteínas subtilisinas.La proteinasa K actúa liberando al ADN nuclear, mientras destruye a las proteínas e inactiva a las RNasas y las DNasas, es decir, elimina a las nucleasas en las preparaciones de ADN y ARN.

Dietilpirocarbonato: El DEPC se descompone en etanol y CO2, que son volátiles. Una vía para eliminar la degradación de RNA durante la extracción es desnaturalizar todas las proteínas celulares, incluyendo las RNasas.

EDTA: Es un agente quelante de iones metálicos como Ca++ y Mg++. Inhibe la acción de las nucleasas al no haber cofactores libres para su actividad y así protege al ADN. Se prepara a pH, elimina cationes de la solución, estabiliza membranas e inhibe RNasas.

¿Se podría utilizar el EDTA u otro agente quelante para inhibir las RNasas? ¿Por qué?

Si, los agentes quelantes son sustancias que forman complejos con iones de metales pesados. (como el EDTA) se emplean para proteger el ADN de la acción de enzimas nucleasas; Los agentes quelantes capturan los iones y no permiten que actúen como cofactores de estas enzimas. Las altas concentraciones de NaCl se utilizan para prevenir la contaminación de las muestras con polisacáridos que afectan la pureza de los ácidos nucleicos.

Describa el Método de Extracción de RNA por Columnas de Sílica.

Esta metodología se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos a membranas de sílice, en presencia de sales caotrópicas.

Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una capa de agua que mantienen su solubilidad en soluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos, se destruye esta capa hidratante, creando un entorno hidrofóbico, lo cual permite que el ARN se una a la membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas y otros contaminantes no se unen y son eliminados durante los pasos de lavado. Los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana utilizando tampones de elución con ↓ [sales] (ligeramente alcalinos) o agua, que permiten recuperar la capa hidratante liberando los de la membrana, sin afectar el ARN.

Comente brevemente respecto a los Kits de extracción de RNA, según las muestras biológicas a trabajar.

Tabla 1: Fundamentos de algunos kits de extracción de RNA según algunas muestras biológicas.

Fuente: (Extracción de ARN por tipo de muestra, 2018)

MUESTRA BIOLÓGICA KITS DE EXTRACCIÓN DE RNA

OBJETIVO NOMBRE CUALIDADES

SANGRE Eliminación de eritrocitos no nucleados Purelink REACTIVOS: EDTA, heparina y citrato.

MÉTODO: Columna de sílice rápida y conveniente.

TIEMPO: 20 min.

HTP optimización para la purificación de sangre estabilizada MagMax en tubos de sangre estabilizada REACTIVOS: Tubos, Tempus o PaxGene

MÉTODO: Formato escalable y flexible con perlas magnéticas

TIEMPO: 12 tubos en 2 horas.

Alto rendimiento de ARN de sangre sin aislamiento de leucocitos RiboPure REACTIVOS: EDTA, heparina, citrato y RNA más tarde.

MÉTODO: Extracción orgánica y columna de sílice sin precipitación.

TIEMPO: 30 min.

CÉLULAS CULTIVADAS RNA intacto de gran pureza Reactivo TRIzol MÉTODO: Extracción orgánica de alta

pureza con precipitación de alcohol.

USO: Todos los métodos de expresión de RNA.

TIEMPO: 1 hora.

Formato de columnas rápido y conveniente para RNA Mini kit PureLink RNA MÉTODO: Lisis no tóxica de guanidina isotiocianato.

USO: qRT-PCR, NGS.

TIEMPO: 20 minutos.

BACTERIAS Sin procedimiento de lisis TRIzol Max

Bacterial RNA

Isolation Kit con TRIzol & Max MÉTODO: Extracción orgánica de alta pureza con precipitación de alcohol.

TAMAÑO DEL KIT: Hasta 100 preparaciones.

TIEMPO: 1 hora

Para bacterias gram (+) con

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