Guía De técnicas Inmunológicas

- GUIA DE TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS 2010 -

INDICE

1. Interacción antígeno-anticuerpo Página 1

2. Interacción Secundaria Ag-Ac Página 1

2.a. Reacciones de precipitación Página 1

2.b. Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de precipitación. Página 2

Inmunodifusión Radial Página 2

Inmunoelectroforesis Página 2

2.c. Reacciones de aglutinación Página 3

2.d. Concepto de título Página 5

3. Interacción primaria Ag-Ac Página 7

3.a. Inmunomarcación Página 7

Inmunomarcación con Acs conjugados a ENZIMAS Página 8

Inmunomarcación con Acs conjugados a FLUOROCROMOS Página 8

Citometría de Flujo Página 9

3.b. Radioinmunoanálisis y Técnicas radioinmunométricas Página 12

3.c. ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay) Página 13

4. Otras técnicas

4.a. Proteinograma electroforético Página 14

4.b. Nefelometría Página 15

4.c. Western Blot Página 15

5. Técnicas de tipificación de antígenos de histocompatibilidad Página 16

5.a. Técnicas serológicas Página 17

5.b. Técnicas moleculares Página 18

6. Cross match Página 22

7. Técnicas inmunológicas para estudiar la funcionalidad de los fagocitos Página 22

1

1. INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO La unión antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una interacción reversible en la que están involucrados enlaces no-covalentes. En la interacción in vitro de un antígeno (Ag) con su correspondiente anticuerpo (Ac) se distinguen dos etapas, la interacción primaria no visualizable y la interacción secundaria, que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparición de un fenómeno visible como la aglutinación o la precipitación. Por otro lado, no siempre que se produce la interacción primaria Ag-Ac, se produce la interacción secundaria, ya que, para conseguir fenómenos visibles, son indispensables determinadas concentraciones y características de los Ags y Acs. 2. INTERACCIÓN SECUNDARIA ANTIGENO-ANTICUERPO. Las técnicas inmunológicas que evidencian la interacción Ag-Ac a través de una reacción secundaria (precipitación o aglutinación) son, generalmente, más económicas y sencillas que aquellas que permiten visualizar la interacción primaria (ver más adelante). 2.a. Reacciones de precipitación Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs específicos, la interacción Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos, no es otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados por la interacción Ag-Ac. Tal como se observa en la figura, cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad fija de suero conteniendo Acs específicos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la cantidad de precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo, luego del cual declina. En un extremo de la curva de precipitación, cuando se agregan pequeñas cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de Ag siendo pequeños y probablemente constituidos por una molécula de Ac y dos de Ag. Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia, en donde la relación Ag-Ac permite la formación de grandes redes de CI que precipitan.

La reacción de precipitación depende de la VALENCIA del Ac y del Ag. La valencia del Ac da idea del número de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera, un Ac bivalente posee dos sitios capaces de reconocer al Ag. Del mismo modo, la valencia de un Ag nos habla del máximo número de epitopes que posee. Para que se pueda producir la interacción secundaria Ag-Ag con la consecuente formación del precipitado, tanto el Ag como el Ac deben ser, al menos, bivalentes.

Exceso de Ac

Equiva-

lencia

Exceso de Ag

Cantidad de Ag agregado

2

2.b. Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de precipitación.

1- Inmuno Difusión Radial (IDR)

Esta técnica permite cuantificar de manera sencilla y económica inmunoglobulinas de isotipo G, M y A o antígenos solubles (C3, C4, transferrina, etc) presentes en muestras biológicas. La técnica se basa en la difusión de la muestra conteniendo el antígeno a medir (inmunoglobulinas o antígenos solubles) en una matriz semisólida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac específico. La muestra biológica se introduce en los orificios cilíndricos excavados en el agar y a medida que el antígeno difunde en forma radial, se alcanza la relación Ag-Ac que permite la formación precipitados visibles. Una vez finalizada la difusión se mide el radio (R) de los precipitados que es proporcional a la concentración de antígeno (C). La concentración de proteína en la muestra biológica (Cx) se calcula realizando una curva de calibración utilizando muestras patrones de concentración conocida.

2- Inmunoelectroforesis (IEF).

La inmunoelectroforesis es una técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes componentes proteicos presentes en distintas muestras biológicas (suero, orina, etc) a través de arcos de precipitación. La técnica se realiza preferentemente en geles de agarosa y se distinguen dos etapas: 1) La muestras se someten a una separación electroforética.

La asociación entre Ac bivalentes y Ag monovalentes (un único epitope no repetido) no permite la formación de CI precipitantes.

La asociación entre Ac bivalentes y Ag multivalentes permite la formación de CI precipitantes. El Ag multivalente puede presentar un sólo epitope repetido o varios epitopes distintos.

Curva de calibración

Rx

R1

R2

R3

C3

C3

Muestra Biológica de

concentracion desconocida (Cx)

C1

C2

Muestra patrón de concentración conocida (C)

R2

Concentración

de la muestra

C1

C2

Cx

Rx2

Halo de precipitado

3

2) Terminada la electroforesis, las proteínas interaccionan con los Acs específicos aplicados en el agar en un canal paralelo al eje de migración. Luego de un período de difusión de los Acs, se observan arcos de precipitación cuya forma y posición dependen de las características inmunoquímicas y de la concentración de cada proteína. 2.c. Reacciones de aglutinación Las reacciones de aglutinación, tal como vimos para las reacciones de precipitación, involucran una interacción secundaria entre Ag-Ac que llevará a la aparición de un aglutinado que se visualiza como grumos. Los principios fisicoquímicos que gobiernan la formación de estos aglutinados son los mismos que

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