HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA LACTOSA POR β-GALACTOSIDASA (LACTASA)

Universidad Santo Tomás

Escuela de Enfermería

                                                                  Enfermería

                                             Informe de laboratorio

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA LACTOSA POR β-GALACTOSIDASA (LACTASA)

Asignatura: BIO-005

Integrantes: Campusano Pedro, Cisternas Constanza, Ortega Valentina, Valdivia Camila, Vega Xavier.

Docente: Cisternas Jamet Jonathan

           Fecha de realización: Martes 24 de Septiembre de 2019

                Fecha de entrega: Martes 01 de Octubre de 2019

Introducción

Las enzimas son catalizadores de los sistemas biológicos, ya que son capaz de acelerar una reacción química1. estas generalmente son de origen proteico, resultan catalizadores eficientes, estas actúan sobre un sustrato, lo que las hace altamente específicas, capaces de aumentar su velocidad de reacción, disminuyendo la energía de activación, no afectando su estado inicial y su estado final. Algunas enzimas por ejemplo requieren de un componente químico adicional llamado cofactor, los cuales son iones inorgánicos o metal orgánica compleja denominada coenzima 2. La actividad de una enzima puede evidenciarse ya sea registrando la aparición de un producto o bien la desaparición de un sustrato. Investigar la actividad de una enzima implica determinar cuáles son las condiciones óptimas para su actividad: pH, temperatura, concentración de sustrato y concentración de producto. La lactasa (un tipo de β-galactosidasa) es una enzima producida en el intestino delgado, que se sintetiza durante la infancia de todos los mamíferos. Su acción es imprescindible para el proceso de conversión de la lactosa, azúcar doble (disacárido), en sus componentes glucosa y galactosa.

La glucosa reacciona con el reactivo enzimático que contiene una mezcla de las enzimas Glucosa Oxidasa (GOD) y Peroxidasa (POD). En la primera etapa la Glucosa es oxidada a Ac. Glucónico por la acción de la enzima GOD, liberándose como producto H2O2, el cual en una reacción mediada por la enzima POD, reacciona con el Ac. p-Hidroxibenzoico y 4- Aminoantipirina producièndose un compuesto coloreado con un máximo de absorción a 505 nm., en cantidad proporcional a la cantidad de Glucosa presente en la muestra.

Objetivos general

• Determinar la actividad de la enzima β-galactosidasa al ser expuesta a diferentes temperaturas y pH.

Objetivos específicos

• Analizar el efecto que la temperatura y el pH tienen en la actividad enzimática
• Determinar cualitativamente y cuantitativamente la actividad de la enzima mediante el uso del espectrofotómetro.

 Materiales y Métodos

Se preparó una batería de 8 tubos de ensayo rotulados del 1 al 4 en serie de C y D se le agregó agua bidestilada con distintas cantidades, a la serie C se le añadió 1.000µ (1mL), mientras que a los tubos rotulados con la letra D fue una cantidad de 900µ, luego de agregar la cantidades de agua bidestilada se procedió a adicionar 100µ de la solución enzimática β-Galactosidasa a los tubos D, posteriormente se incubaron los tubos durante 5 minutos a distintas temperaturas, los tubos 1 a una temperatura 4ºC en Hielo, en cambio, los tubos 2 a una tempera ambiente de 19ºC, al mismo tiempo se incubaron los tubos 3 a una temperatura de 35ºC en un baño termorregulado y por último, los tubos 4 se incubaron en un baño termorregulador a 60ºC. Una vez terminado ese periodo de 5 minutos se procedió a adicionar 1.000µ, sin haber retirar del baño y de manera rápida la Lactosa a los Tubos D, además de homogenizar la solución con la Lactosa, posteriormente se dejó por 5 minutos correspondientes en cada baño, luego de cumplir el tiempo, a los tubos C y D se dejó en un baño termorregulado a 100ºC por 2 minutos, luego se enfriaron en agua fría por 2 minutos, más adelante, se extrajeron los tubos C y D y solamente  a los tubos C se le agregaron 1.000µ de la solución de Lactosa, luego rápidamente a los tubos C y D se le agregaron 2 mL del Kit enzimático SPINREACT GOD-POD, seguidamente se incubó por 10 minutos a 36ºC y por último, se leyó la absorbancia de cada muestra contra su blanco, respectivo a 505 nm.

Resultados

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Gràfico 1: Curva de variación de velocidad de reacción con respecto al pH.

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Gráfico 2: Curva de variación de velocidad de reacción con respecto al pH.

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Gráfico 3: Curva de variación de velocidad de reacción con respecto a la temperatura.

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Gráfico 4: Curva de variación de velocidad de reacción con respecto a la temperatura.

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Gráfico 5: Curva de variación de velocidad de reacción con respecto a la temperatura.

Discusión

A través del análisis de los resultados, se interpreta el gráfico del  cambio de velocidad de reacción de la enzima en función de la temperatura. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen la norma, pero se debe tener en cuenta que, por ser proteínas, a cierta temperatura, esta se comienza a desnaturalizar.

En el procedimiento experimental, se pudo observar, que las proteínas alcanzan un máximo de actividad enzimática a cierta temperatura, lo que se denomina “temperatura óptima”, la que se observa en el gráfico a una temperatura aproximada de 35ºC, posterior a esta temperatura la actividad enzimática se ve disminuida.

Analizando los resultados de pH, se observa cómo éste afecta en la velocidad de reacción de la enzima, ya que “las enzimas tienen un pH óptimo o un intervalo de pH en el que su actividad es máxima; a valores superiores o inferiores de ph  la actividad disminuye.(4) Esto queda demostrado en los gráficos obtenidos en el análisis de resultados por parte del pH, aunque lo que más lo caracteriza es que su mayor actividad enzimática es a un pH ácido, además de que al ir aumentando el pH a uno básico este se vaya inactivando, debido a la desnaturalización a un pH Básico y extremo como el 12, lo cual podemos comprobar que la estabilidad de la enzima varía y es definida por el pH.

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