HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN, UN POLISACÁRIDO VEGETAL.

Práctica 1.

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN, UN POLISACÁRIDO VEGETAL.

INTRODUCCIÓN.

El almidón es un homopolisacárido de reserva formado por moléculas de glucosa, se encuentra en productos vegetales como la papa, cereales, legumbres, entre otros.

Químicamente, el almidón es una macromolécula formada por amilosa (15-20%) con una estructura helicoidal no ramificada de glucosas (1-4), y amilopectina (80-85%) con estructura ramificada, con glucosas (1-4) en la cadena continua y (1-6) en los puntos de ramificación.

Amilopectina

Cuando las semillas germinan, el almidón es degradado mediante la amilasa que es la encargada de romper los enlaces glucosídicos. Esto, con la finalidad de proporcionar las moléculas de glucosa que serán oxidadas para producir la energía que requiere el embrión para su desarrollo antes de que pueda realizar la fotosíntesis. u

OBJETIVO GENERAL.

• Comprobar la actividad enzimática de las amilasas producidas por semillas de maíz al hidrolizar almidón y dando como producto final unidades de maltosa.

OBJETIVOS PARTICULARES.

• Obtener semillas de maíz germinadas a 5, 3 y 0 días.

• Extraer las enzimas de las semillas germinadas.

• Realizar una curva patrón con maltosa.

• Determinar la actividad de la enzima al hidrolizar almidón.

• Determinar la cantidad de reductores totales producidos de la hidrólisis enzimática.

HIPÓTESIS.

Generada por el estudiante.

MATERIAL Y EQUIPO.

Material por equipo.

1 Mortero con pistilo.

1 Bisturí.

6 Tubos de centrífuga de 15 mL.

1 Parrilla de calentamiento.

2 Vaso de precipitados de 1 L (para Baño María de 25 o C y 100o C).

1 Termómetro.

1 Embudo de filtración de 5 cm de diámetro.

3 Pipetas Pasteur con perilla de hule.

2 Pipetas de 1 mL.

1 Pipeta de 5 mL.

1 Pipeta de 10 mL.

25 Tubos de ensayo.

1 Gradilla.

1 Espectrofotómetro.

1 Centrífuga clínica.

1 Par de celdas.

1 Recipiente plástico para poner hielo.

1 Agitador (Vortex).

Material proporcionado por los alumnos.

3 Bolsas de gasa.

20 Semillas de maíz.

Material por grupo.

1 Balanza de 2 platos.

Hielo.

Reactivos.

• Hipoclorito de sodio.

• Ácido succínico.

• CaCl2.

• Maltosa.

• Na CO3 anhidro.

• Tartrato de Na y K.

• NaHCO3.

• NaSO4 anhidro

• CuSO4 5 H2O.

• H2SO4.

• Molibdato de amonio.

• Arsenato de sodio .7H2.

• Almidón.

Soluciones.

• Hipoclorito de sodio al 1%. Hacer una dilución 1:100 de cloro comercial.

• Amortiguador de Succinato-CaCl2. Ácido succínico 0.02 M, CaCl2 0.02 N. Ajustar a pH 5 con NaOH 0.1 M.

• Patrón de Maltosa: 500 ug/mL. Pesar 0.05 g de maltosa y aforar a 100 mL con agua destilada.

• Almidón: 20 mg/mL. Pesar 800 mg de almidón soluble y disolver en 5 mL de agua destilada. Agregar a 15 mL de agua hirviendo y continuar durante un minuto. Enfriar y finalmente agregar 20 mL de amortiguador de Succinato- CaCl2. (Se prepara al momento de usarlo).

• Solución A. Tartrato doble de Na y K. Disolver 25 g de Na CO3 anhidro, 25 g de Tartrato de Na y K, 20 g de Na HCO3 y 200 g NaSO4 anhidro. Aforar a 1 litro de agua destilada.

• Solución B. Sulfato cúprico. Disolver 30 g de CuSO4 . 5 H2O en 200 mL de agua destilada que contenga 4 gotas de H2SO4 concentrado.

• REACTIVO I. Agregar 1 mL de la Solución B a 25 mL de la Solución A. (Preparar unos minutos antes de usarse).

• REACTIVO II. Disolver 25 g de Molibdato de amonio en 450 mL de agua destilada, que contenga 21 mL de H2SO4 concentrado. Por separado, disolver 3 g de Arsenato de sodio .7H2O en 25 mL de agua y agregar a la solución anterior, despacio y con agitación constante (emplear agitador magnético). Aforar a 500 mL, incubar a 37ºC por una noche y posteriormente en un baño de agua a 55ºC durante 30 minutos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.

A. Actividad previa a la realización de la práctica.

1. Cinco días antes de la práctica, elegir 10 semillas de maíz grandes y sanas. Desinfectar las semillas, poniéndolas a remojar durante 3 minutos en hipoclorito de sodio al 1%. Después, lavarlas varias veces con agua hervida fría, para que queden libres de impurezas y del desinfectante.

2. Sembrar las semillas en una caja de Petri (o frasco limpio) que contenga algodón estéril y húmedo. Revisar que permanezca húmedo durante el tiempo de la germinación.

3. Tres días antes de la práctica, elegir otras 10 semillas, desinfectarlas y sembrar en otra caja de Petri (o frasco limpio) como se indicó en el paso 1 y 2.

4. Elegir una semilla para ser utilizada el día de la práctica.

B. Preparación del extracto enzimático (realizar todo el procedimiento en hielo).

1. Poner en agua una semilla de maíz sin germinar durante 5-10 minutos que será la de cero días de germinación.

2. Seleccionar una semilla de tres días y otra de cinco días de germinación.

3. Quitar a las semillas germinadas el embrión o plántula y el escutelo (según el caso) con el bisturí, dejando el endospermo almidonoso (ver figura).

4. Preparar un extracto enzimático de cero, tres y cinco días de germinación (A, B y C, respectivamente) de la siguiente manera:

a) Macerar

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