INFORME OXIDACIONES BIOLOGICAS

OXIDACIONES BIOLÓGICAS

Karla Ahumada, Yanine Castillo, Javier Peralta, Almendra Ríos, Sofía Saldívar.

e-mail contacto: kahumada@alumnosuls.cl, ycastillo@alumnosuls.cl, jperalta@alumnosuls.cl, Aríos@alumnosuls.cl, ssaldivar@alumnosuls.cl

RESUMEN

     En la experiencia de laboratorio se estudiaron  las oxidaciones biológicas más específicamente la actividad de la deshidrogenasa láctica y se analizaron algunos factores que afectan su actividad utilizando azul de metileno como aceptor final de electrones, ya que ocurre la conversión de ácido láctico a acido pirúvico por la acción de la enzima; la determinación de la actividad enzimática por fermentación alcohólica pudo observarse con la decoloración del azul de metileno, en ambos ensayos experimentales fue muy importante mantener el ambiente anaeróbico ; también se determinó la actividad de la deshidrogenasa succínica en un extracto de riñon o corazón y los factores que influyen en su actividad; por otra parte estudiaremos el citocromo oxidasa de un extracto de corazón, observándose la oxidación de la p-fenilendiamina en las reacciones positivas ; además demostramos la actividad peroxidásica y catalásica de la sangre, para esta última veremos el efecto de algunos inhibidores en su reacción; y finalmente realizaremos un análisis de orina humana que compararemos con los valores normales para comprobar que no hayan anormalidades.

PALABRAS CLAVE: oxidación, electrones, deshidrogenasa, actividad enzimática, inhibidor.

INTRODUCCIÓN

La oxidación biológica consiste esencialmente en la remoción de electrones de un sustrato, fenómeno que puede estar acompañado de adición de oxígeno, o de perdida de hidrogeno. En las oxidaciones biológicas lo normal es que se produzca la sustracción de hidrógenos, por lo tanto, la oxidación es sinónimo de deshidrogenación.

La oxidación de una sustancia se acompaña siempre de la reducción de otra, que es el agente oxidante, es decir, son reacciones de óxido-reducción o sistema redox. En todo sistema redox se distinguen:

• Un donador de electrones ( o hidrógenos)
• Un aceptor de electrones
• Un catalizador, o enzima en los tejidos vivos

Esquemáticamente, un sistema óxido-reductor que funciona por deshidrogenación puede escribirse:

                        AH2 + B                   A2 [pic 4]

En que AH2 representa el metabolismo o sustrato y B representa aceptor de H, que puede ser directamente el O2 en caso de las oxidasas; coenzimas o citocromos en caso de las deshidrogenasas, los que transportan el H hasta el O activado. Así las oxidasas, utilizan directamente el oxígeno molecular, en cambio las deshidrogenasas no son capaces de ello, sino  que requieren de múltiples cofactores  antes de completar el ciclo oxidativo.

Mediante estas reacciones de oxidación-reducción se transforman las moléculas orgánicas que se caracterizan por su elevada energía potencial, liberan energía la cual en las células es almacenada en forma de energía química.

La cadena respiratoria mitocondrial o cadena de transporte de electrones está embebida en la membrana interna mitocondrial, y la constituyen cinco complejos multienzimáticos (I, II, III, IV y V o ATP sintasa) y dos transportadores de electrones móviles (coenzima Q o ubiquinona y citocromo c).

Su principal función es el trasporte coordinado de protones y electrones, para producir energía en forma de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. El transporte de electrones genera energía  que es utilizada para transportar protones de la matriz mitocondrial al espacio intermembranal situado entre las membranas mitocondriales externa e interna. Este proceso genera un gradiente electroquímico de protones, que es utilizado por el complejo V (ATP sintasa) para generar ATP a medida que los protones fluyen de nuevo desde el espacio intermembrana a la matriz mitocondrial. El ATP generado es exportado al citoplasma a través del transportador de nuecleótidos de adenina (ANT). 

[pic 5]

Componentes de la cadena respiratoria:

• Coenzimas: NAD y FAD.
• Coenzima Q: es un compuesto muy liposoluble, que difunde con mucha facilidad a través de la membrana y lleva a cabo la siguiente reacción:

CoQ + 2 H → CoQH2

• Proteínas ferrosulfuradas: o proteínas Fe-S. Tienen complejos de hierro y azufre que funcionan como un par redox que puede tomar electrones.
• Citocromos: son hemoproteínas con un hierro. Se conocen varios citocromos: b, c1 c, a y a3. La c es hidrosoluble. El grupo hierro sufre la siguiente reacción:

Fe2+ → Fe3+

MATERIALES Y MÉTODOS

1. DETERMINACION DE LA DESHIDROGENASA LACTICA USANDO AZUL DE METILENO COMO ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES.

Se prepararon 4 tubos de ensayo, al tubo N°1 se le adiciono 1 mL de lactato de sodio 2% seguido de 1 mL de KCN 0,5%, 1 mL de agua destilada y 1 mL de extracto de hígado, luego se le agregó 1 mL de azul de metileno 0,02%, se agito y se le agrego 2 gotas de aceite, al tubo N°2 se le adiciono 1 mL de lactato de sodio, 1 mL de KCN 0,5%, 1 mL de azul de metileno, 1 mL  de extracto de musculo y 1 mL de extracto de hígado, se agito y se le agrego 2 gotas de aceite, al tubo N°3 se le adiciono 1 mL de KCN  0,5% 1 mL de azul de metileno, 1 mL de H2O(d), 1 mL de extracto de musculo y 1 mL de extracto de hígado, se agito y se agregó 2 gotas de aceite, al tubo N°4 se le adiciono 1 mL de lactato de sodio,1 mL de KCN 0,5%,1 mL de azul de metileno 2 mL de H2O(d) y se le agrego dos gotas de aceite. Finalmente todos los tubos se intubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, una vez transcurrido ese tiempo se observa y evalúa la coloración que presenta cada tubo.

1. DETERMINACIÓN DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA USANDO AZUL DE METILENO COMO ACEPTOR DE ELECTRONES.

Se prepararon y rotularon 6 tubos de ensayo, limpios y secos. Al tubo 1 se le adicionaron 2 mL de agua destilada, 1 mL de azul de metileno 0,02 % y 1 mL de enzima (levadura). Al tubo 2 se le adicionó 1 mL de glucosa 25 g/L, 1 mL de agua destilada, 1 mL de azul de metileno 0,02 % y 1 mL de enzima. Al tubo 3 se le adicionó 1 mL de glucosa 25 g/L, 1 mL de fluoruro de sodio 0,1 M, 1 mL de azul de metileno 0,02 %  y 1 mL de enzima. Al tubo 4 se le adicionó 1 mL de glucosa 25 g/L, 1 mL de fluoruro de sodio 0,01 M, 1 mL de azul de metileno 0,02 % y 1 mL de enzima. Al tubo 5 se le adicionaron 1 mL de glucosa 25 g/L, 1 mL de formalina, 1 mL de azul de metileno 0,02 % y 1 mL de enzima. Finalmente al tubo 6 se le adicionaron 1 mL de glucosa 25 g/L, 1 mL de agua destilada y 1 mL de azul de metileno 0,02 %.  Posteriormente todos los tubos se agitaron y se le adicionó a cada uno 5 gotas de aceite. Se dejaron en observación durante 1 hora aproximadamente.

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