Informe Cinetica BQ

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Irjuba Bioquímica I

2º Grado en Biología

Facultad de Biología Universidad de Vigo

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.

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Estudio de la enzima β-D-galactosidasa en sobrenadante de hígado de rata.

Bioquímica I: prácticas 2 a 5

2º BIOLOGÍA 2020/2021

Iria Juárez Bastos Laura Portela Couñago

Grupo 4

Universidad de Vigo

ÍNDICE:

PRÁCTICA 2.- DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA β- DGALACTOSIDASA EN SOBRENADANTE DE HÍGADO DE RATA        1

Parte a) Elaboración de una recta patrón de PNF        1

Parte b) Valoración de la actividad de la enzima β-D-galactosidasa        2

PRÁCTICA 3.-DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO DE LA ENZIMA β- DGALACTOSIDASA        5

PRÁCTICA 4.- EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA β-D-GALACTOSIDASA. CÁLCULO DE PARÁMETROS CINÉTICOS        7

PRÁCTICA 5.- EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ESTABILIDAD DE LA ENZIMA β-D-GALACTOSIDASA        10

TABLAS:

Tabla 1: Resultados obtenidos absorbancia y micromoles de PNF para elaboración recta patrón PNF        1

Tabla 2: Resultados obtenidos de absorbancia, diferencia de absorbancias y micromoles de PNF para estudiar actividad enzimática        2

Tabla 3: Resultados obtenidos de absorbancia, diferencia de absorbancias y porcentaje de absorbancia para el estudio del pH óptimo de la enzima        5

Tabla 4: Resultados de absorbancia y parámetros cinéticos        7

Tabla 5: Resultados de absorbancia con las distintas temperaturas        10

GRÁFICOS:

Gráfico 1: Recta patrón PNF        2

Gráfico 2: Representación del pH frente a la absorbancia de la enzima        5

Gráfico 3: Curva de Michaelis-Menten        8

Gráfico 4: Recta de Linneawever-Burk        8

Gráfico 5: Gráfico porcentaje de absorbancia frente a temperatura        10

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ESTUDIO DE LA ENZIMA β-D-GALACTOSIDASA EN SOBRENADANTE DE HÍGADO DE RATA

PRÁCTICA 2.- DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA β- DGALACTOSIDASA EN SOBRENADANTE DE HÍGADO DE RATA

El objetivo es calcular la actividad de la enzima estudiada, por lo que debe tenerse en cuenta que cataliza la hidrólisis de moléculas que presenten D-galactosa unida mediante un enlace β (1,4) a otro monosacárido. Por ello, se utilizará como sustrato p-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (PNF- gal), pues presenta dicho enlace y el producto de su catálisis es medible en espectrofotómetro a 400 nm (es de color amarillo).

En primer lugar, debe elaborarse una recta patrón de PNF, para poder interpolar las concentraciones de las muestras. Esta se obtiene midiendo la absorbancia de diez soluciones de diferente concentración. A continuación, se prepara un tubo con sustrato, tampón de pH 4 y muestra enzimática diluida 3 veces. Se incuba a 37ºC durante 20 minutos, tras lo que se detiene la reacción con Na2CO3 y se mide la absorbancia a 400 nm. Con los datos obtenidos se calcularán las variables cinéticas necesarias.

Parte a) Elaboración de una recta patrón de PNF

RESULTADOS:

Tabla 1: Resultados obtenidos absorbancia y micromoles de PNF para elaboración recta patrón PNF

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1. Elaborar una recta patrón de PNF, representando en abscisas los μmol PNF y en ordenadas la absorbancia a 400 nm de cada tubo.

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Gráfico 1: Recta patrón PNF

1. Obtener la ecuación de la recta y su 𝑹𝟐 , que debe ser >0.98.

La ecuación de la recta es la siguiente: y = 0’006 x + 0’048. Su coeficiente R2  es de 0’991, lo que indica que la recta se ajusta correctamente a los valores reales obtenidos.

Parte b) Valoración de la actividad de la enzima β-D-galactosidasa

RESULTADOS:

Tabla 2: Resultados obtenidos de absorbancia, diferencia de absorbancias y micromoles de PNF para estudiar actividad enzimática.

1. ¿Qué diferencia hay entre el Blanco y el Blanco enzima?

La diferencia reside en que el blanco enzima, como bien dice su nombre, contiene la enzima de estudio, más concretamente 0,3 mL y el blanco, por el contrario, no. Por otro lado, el blanco contiene   agua,   tampón   fosfato,   Na2CO,   sustrato   PNF-gal   y   se   utiliza   para   calibrar   el

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espectrofotómetro, mientras que el blanco enzima contiene agua, tampón fosfato, Na2CO3    y la enzima estudiada, y es usado para conocer la absorbancia de la enzima.

1. ¿Por qué se utiliza un blanco enzima?

El blanco contiene 0,3 mL de agua, 0,3 mL de tampón, 1,5 mL de Na2CO3   y 0,4 mL de sustrato PNF-gal. Se utiliza para calibrar el espectrofotómetro, es decir, para que en las siguientes medidas no se tenga en cuenta la absorbancia de esos componentes. El blanco enzima, en cambio, contiene 0,4 mL de agua, 0,3 mL de tampón, 1,5 mL de Na2CO3   y 0,3 de enzima. Su función es, tras haber calibrado el espectrofotómetro con el blanco, conocer la absorbancia de la enzima. Pues al conocer este dato puede descontarse de la absorbancia registrada en el tubo con la muestra, para así saber cuál es el valor que corresponde al PNF. De esta forma puede conocerse la actividad de la enzima, entre otros datos.

1. ¿Por qué la reacción se lleva a cabo a pH ácido?

Se lleva a cabo a pH ácido porque se estudia una enzima lisosómica que pierde su actividad a pH neutros. Por lo que si se llevase a cabo a pH básico o neutro no tendría lugar ninguna reacción o sería mínima.

1. ¿Por qué el Na2CO3 detiene la reacción enzimática?

Esta sal disuelta en agua eleva el pH de la solución. La enzima en estudio solamente es activa a pH ácido, por lo que al añadir la sal y aumentar el pH, la reacción se detiene.

1. ¿Por qué todos los tubos tienen el mismo volumen final que los tubos utilizados para elaborar la recta patrón?

Todos los tubos deben tener el mismo volumen final para que sea correcto comparar las muestras con la recta patrón y utilizar dicha recta.

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