PCR en el diagnóstico de la infección : Detección de Las bacterias en fluidos cefalorraquídeo

PCR en el diagnóstico de la infección : Detección de Las bacterias en fluidos cefalorraquídeo

La PCR es el más sensible de los métodos rápidos existentes para detectar patógenos microbianos en muestras clínicas. En particular, cuando se espera que los agentes patógenos específicos que son difíciles de cultivar in vitro o que requieren un período de cultivo largo a estar presentes en las muestras, el valor diagnóstico de PCR se sabe que es significativo. Sin embargo, la aplicación de PCR para muestras clínicas tiene muchos peligros potenciales debido a la susceptibilidad de PCR a los inhibidores, la contaminación y las condiciones experimentales. Por ejemplo, se sabe que la sensibilidad y especificidad de un ensayo de PCR es dependiente de los genes diana, secuencias de cebadores, técnicas de PCR, procedimientos de extracción de ADN, y métodos de detección de productos de PCR. A pesar de que hay muchas publicaciones sobre los protocolos básicos de un ensayo de PCR, INCLUYENDO extracción de ADN y preparación, así como la la amplificación y detección de amplicones, la detección por PCR de bacterias en muestras clínicas tales como líquido cefalorraquídeo (LCR) aún no ha sido revisado. Desde una variedad de muestras clínicas, tales como sangre, orina, esputo, líquido cefalorraquídeo y otros, variar en cuanto a la naturaleza del contenido y la cantidad disponible, cuidadoso diseño del ensayo de PCR para cada muestra específicos antes de que se llevó a cabo una aplicación PCR es esencial. En particular, un diagnóstico basado en la detección de unas pocas bacterias en muestras clínicas mediante el uso de PCR debe ser cuidadosamente evaluado técnicamente, así como micro biológicamente. A este respecto, los estudios actuales relativos a la detección de Chlamydia pneumoniae en CSF obtenidas de pacientes con esclerosis múltiple (EM) mediante el uso de PCR proporcionan un buen ejemplo para la discusión de la utilización del ensayo de PCR en el diagnóstico. Debido a C. pneumoniae es difícil de cultivar in vitro, a menudo un bajo número de bacterias se pueden detectar en el LCR de pacientes con enfermedades neurológicas crónicas por PCR. Por lo tanto, en esta revisión protocolos de PCR generales para la detección de bacterias en muestras clínicos, así como un ejemplo específico de la utilización de PCR para la detección de C. pneumoniae en CSF, será discutido.

ASPECTOS METODOLÓGICOS

El ensayo de PCR en el diagnóstico implica varios pasos críticos , tales como la extracción de ADN a partir de muestras , la amplificación por PCR , y la detección de amplicones . En particular, cuando las muestras clínicas específicas, tales como CSF , con sólo unas pocas bacterias presentes son probado por PCR , cada procedimiento debe diseñarse y realizarse con cuidado.

CSF. CSF se utiliza ampliamente para el diagnóstico de enfermedades del sistema nervioso central (SNC). Debido CSF tiene funciones importantes, incluyendo amortiguando el cerebro, el mantenimiento de una presión intracraneal constante, proporcionando nutrientes, y la eliminación de metabolitos tóxicos del CNS, una evaluación indirecta de la condición de cerebro puede ser obtenido a partir del CSF. Desde CSF se considera libre de gérmenes, la detección de microbios en CSF, incluso en bajas cantidades, proporciona información valiosa acerca de una posible infección. Sin embargo, hay que señalar que la detección de microbios en el CSF no siempre indica una infección del SNC, ya que el deterioro de la barrera sangre-cerebro puede permitir el tránsito de los microbios. Sin embargo, la detección, identificación de microorganismos en el LCR es importante en el diagnóstico de meningitis y otras infecciones del SNC. En particular, estudios recientes indican la posible participación de microorganismos en las enfermedades específicas del CNS, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y la MS. Por lo tanto, la detección de incluso unos pocos microorganismos en CSF por un protocolo estandarizado es un asunto crítico para el diagnóstico de tales enfermedades. El adulto normal produce aproximada- mente 500 ml de LCR por día, con aproximadamente 150 ml de LCR en el SNC en un momento dado. Por lo tanto, la cantidad disponible de LCR y el número de muestras para el diagnóstico son limitados. Por lo tanto, la realización de PCR utilizando una muestra de LCR se convertirá en la prueba de diagnóstico de primera línea para infecciones del SNC, debido a una sensibilidad que requiere sólo una cantidad limitada de CSF, la especificidad del ensayo, y velocidad. De hecho, se ha informado de una serie de ensayos utilizando PCR para la detección de una amplia gama de bacterias en muestras de LCR. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad del ensayo de PCR para la detección de patógenos no puede ser mejor que los de ensayo de cultivo, que ha sido estandarizado y validado para la mayoría de los patógenos, debido a la fiabilidad de sensibilidad de la PCR en el proceso de ensayo. Por lo tanto, un resultado negativo de PCR se puede utilizar con confianza moderada para descartar un diagnóstico de la infección.

La estabilidad del ADN bacteriano objetivo durante el almacenamiento CSF es una importante cuestión práctica en laboratorios clínicos. Sin embargo, sólo información limitada sobre los efectos de varias condiciones de manipulación y almacenamiento en la estabilidad del ADN bacteriano en CSF está disponible. La exposición de CSF a diversas condiciones ambientales, tales como temperatura ambiente frente a 4 ° C durante hasta 96 h y congelación-descongelación hasta tres veces, no afecta a la capacidad de un ensayo de PCR de alta sensibilidad para detectar el ADN bacteriano en muestras de LCR.

Ese informe, sin embargo, tuvo un resultado sólo se limita condiciones ambientales. Por lo tanto, el almacenamiento y la manipulación de CSF adecuada siguen siendo esenciales para la detección de microbios después de la amplificación PCR.

Contaminación. Dado que la PCR se basa en la amplificación de ADN, se pueden producir fácilmente resultados falsos positivos o negativos . En particular, un único ciclo de PCR resultados en un gran número de moléculas amplificables que potencialmente pueden contaminar amplificaciones subsiguientes de la misma secuencia objetivo. De hecho, una fuente primaria de falsos positivos ha sido

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