PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN PARA Staphylococcus spp.

1. PRÁCTICA N°4: PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN PARA Staphylococcus spp.
2. Objetivos

1. Objetivo general

Conocer las principales características del género Staphylococcus spp. y los métodos de identificación en el laboratorio.

2.2 Objetivos específicos

Conocer el fundamento y realizar los procedimientos de laboratorio diseñados para diferenciar las principales especies de Staphylococcus spp. patógenos humanos.

Interpretar los resultados de las pruebas de identificación para especies de Staphylococcus spp.

1. Marco teórico

Palabras clave: Staphylococcus spp., cocos Gram positivos catalasa positiva microbiota de la piel, factores de virulencia.

Los cocos Gram positivos pertenecen a un grupo heterogéneo de bacterias cuya característica común es su forma esférica, su reacción frente a la tinción de Gram y la ausencia de endoesporas. Dentro de este grupo se encuentra el género Staphylococcus, un género ubicuo, que tiene una alta importancia clínica por alta prevalencia de aislamiento en muestras clínicas. Se encuentran representantes tanto patógenos como comensales (1).

El género Staphylococcus pertenece a la familia Staphylococcaceae. Son cocos Gram-positivos agrupados generalmente en forma de racimos de uva. Son anaerobios facultativos y mesófilos. (1).

Se encuentran diseminados en la naturaleza, y son comensales de humanos y animales, muchos estafilococos hacen parte de la flora normal de la piel y mucosas del tracto respiratorio superior. La disrupción de la piel o membranas mucosas actúan como puerta de entrada en tejidos subyacentes (2).

Las tres especies más representativas son: S. aureus, S. saprophyticus y S. epidermidis, siendo generalmente no virulentas las dos últimas especies. Sin embargo S. epidermidis puede llegar a ser el agente etiológico de lesiones cutáneas, y enfermedades importantes como la endocarditis, y S. saprophyticus agente causal de infecciones del tracto urinario. S. aureus por su parte está implicado en la formación de abscesos purulentos y menos frecuentemente en el desarrollo de neumonías, osteomielitis, endocarditis, cistitis, pielonefritis, enteritis y septicemia (1, 2).

Las cepas de S. aureus producen una variedad de productos metabólicos,  algunos de ellos implicados en su patogenicidad. Entre estos se encuentran los que actúan como factores de virulencia: La coagulasa (Ayuda a la formación del coágulo), la leucocidina (Lisa leucocitos), las hemolisinas (Lisan hematíes), la enterotoxina (Responsable de la gastroenteritis). Y aquellos metabolitos que no tienen una naturaleza tóxica como DNasas, lipasas, gelatinasas y la estafilocinasas, pero que son importantes en funciones propias del metabolismo bacteriano (1-3).

Las principales pruebas de laboratorio para identificar cepas de Staphylococcus spp. Son:

• Catalasa: Es una enzima producida por algunas bacterias con el fin de neutralizar los efectos bactericidas del peróxido de hidrógeno (H2O2), principalmente para evitar la formación de radicales tóxicos en las células fagocíticas. La enzima descompone el H2O2 en agua y oxígeno, lo cual se evidencia por la formación rápida de burbujas. Se puede correlacionar la concentración de catalasa presente en la bacteria con su patogenicidad. La prueba de la catalasa se emplea para diferenciar a cocos Gram positivos pertenecientes a las familias Staphylococcaceae y Micrococcacea con la Streptococcaceae, siendo los dos primeros positivos (1).
• Agar salado manitol: Es un medio selectivo para aquellos microorganismos que toleran las sales, tales como los estafilococos. Después de la incubación las cepas típicas de S. aureus muestran un halo amarillo que rodea su crecimiento lo que evidencia la degradación de manitol (carbohidrato). Las cepas no fermentadoras no mostrarán cambio de color en el medio (1).
• Prueba de la coagulasa: La producción de coagulasa es indicativa de cepas de S. aureus. Esta enzima convierte el fibrinógeno en fibrina, la fibrina forma una malla que rodea las células bacterianas o los tejidos infectados, protegiendo así a los microorganismos de los mecanismos de respuesta inespecíficos del hospedador.  Al poner en contacto una suspensión de S. aureus con plasma, éste es capaz de coagularlo luego de cuatro horas, un resultado negativo (no formación de coágulo) es indicativo de una cepa no virulenta (1).
• Test de la DNasa: Generalmente los estafilococos coagulasa positivo también producen la enzima DNasa. Los microorganismos son sembrados en agar DNasa, después de la incubación, la actividad de la DNasa es determinada por la adición de ácido clorhídrico 1N. Aquí el ADN hidrolizado presenta transparencia y el ADN polimerizado se precipita tornando el medio a un color opaco. La presencia de halo es indicativa de un resultado positivo, por lo tanto de la habilidad del microorganismo de producir Dnasa (1).
• Sensibilidad a la Novobiocina: Esta prueba es empleada para diferenciar S. Epidermidis de S. Saprophyticus. Para ello se requiere la inoculación masiva de los microorganismos a evaluar en agar Mueller-Hinton y la aplicación de un sensidisco de Novobiocina en la superficie del agar. Después de la incubación, la sensibilidad de los microorganismos será evaluada mediante la determinación de halos de inhibición del crecimiento (3).

4. METODOLOGÍA

1. Procedimiento

Las muestras se deben procesar según las indicaciones del docente siguiendo estrictamente todas las medidas de bioseguridad. Toda manipulación a los cultivos debe hacerse cerca al mechero encendido. Tendrá tres bacterias del genero Staphylococcus spp. identificadas como 001-002 y 003 que usará para los montajes.

1. Coloración de Gram:

• Haga un frotis bacteriano, deje secar al aire libre cerca al mechero y fije por calor.
• Añada 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por completo. Deje actuar el colorante durante 1 minuto. Una vez transcurrido el tiempo, lave la preparación con agua.
• Agregue 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y deje actuar 1 minuto.
• Transcurrido el tiempo, lavar con agua.
• Con cuidado, añada gota a gota el alcohol-acetona dejar actuar 30 segundos, luego lave con agua.
• Añada el colorante de contraste, safranina-fushina (1 ó 2 gotas) y deje actuar durante 1 minuto, luego lave con agua.
• Escurra y deje secar al aire
• Observe al microscopio a 100X con aceite de inmersión.
• Dibuje sus observaciones.

1. Prueba de la catalasa: Tome una pequeña cantidad de bacterias del cultivo primario, con ayuda de un asa microbiológica,  y llévelas a una lámina portaobjetos que contiene una gota de peróxido de hidrógeno al 3%, realice una emulsión bacteriana y observe.
2. Prueba de la fermentación de carbohidratos y tolerancia a las sales: Divida la placa de agar salado manitol en tres secciones e identifíquelas. Asépticamente haga una línea de inoculación, para cada microorganismo, en su respectiva zona de inoculación. Incube a 37°C en aerobiosis, por un periodo de 24 a 48 horas. Observe los resultados.
3. Prueba de la DNasa: Divida la placa de agar DNasa, en tres secciones e identifíquelas. Asépticamente haga una línea de inoculación, para cada microorganismo, en su respectiva zona de inoculación. Incube a 37°C en aerobiosis, por 24 a 48 horas. Evidencie los resultados después de añadir ácido clorhídrico 1N, en cantidad suficiente para que cubra toda la superficie de la placa de cultivo. Observe los resultados.
4. Prueba de la novobiocina: Divida la placa de agar sangre en tres secciones e identifíquelas. Siembre masivamente la bacteria en cuestión. Inocule con una cepa diferente cada zona por medio de siembra masiva, dejando aproximadamente 1mm a cada lado. Luego, en el centro de la superficie de cada zona de siembra ponga un sensidisco de Novobiocina con la ayuda de pinzas estériles. Incube a 37°C en aerobiosis, por 24 a 48 horas .Observe los resultados.
5. Prueba de la coagulasa en tubo: Tome una colonia o suspensión bacteriana, con ayuda de un asa microbiológica, emulsifique dentro de un tubo que contiene 0.5ml de plasma. Tape e incube el tubo a 37°C durante 4-18 horas, observe los resultados.

4.1 Materiales, equipos y reactivos

Tabla 1. Materiales, equipos y reactivos requeridos

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