Practica De Extraccion De ADN Plasmidico

Introducción

Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosomal los cuales están presentes en algunas células bacterianas, levaduras y hongos. Los mismos poseen DNA de doble hebra, mayormente son circulares pero también se han encontrado plásmidos lineales. La replicación de los plásmidos es independiente de la replicación del cromosoma del huésped ya que los plásmidos poseen su propio origen de replicación. El número de copias de un plásmido en la célula es variable, todo depende del origen de replicación del que posea el mismo y su regulación. Los plásmidos no son esenciales para el desarrollo o supervivencia de la célula pero le proveen una ventaja competitiva a las células que los poseen, dado a que los plásmidos poseen genes que le confieren características selectivas a su huésped tales como resistencia a antibióticos, nuevas habilidades metabólicas como degradación de carbohidratos, factores de virulencia y producción de toxinas entre otros.

Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de vector recombinante.

Materiales y métodos

Materiales

Micropipetas. Etanol.

Agua. Isopropanol.

Cloroformo alcohol isoanilico 24:1 Fenol.

Solución (II). Solución (III).

Cultivo. Centrifuga.

Tubos de policarbonato. DNA plamisdico.

 Del inoculo se toma 1½ ml en un tubo de policarbonato y de pone a centrifugar a 10000 rpm por 2 minutos, ya que se realizo esta operación se decanta el sobrante y se pone 1 mc de cultivo y se centrifuga otra vez.

 Se resuspede la pastilla con 100 mc de solución (I) y se deja 5´ a TA se debe de tener en cuenta que se tiene que quedar bien homogenizado.

 Agregar 200 mc de solución (II) nos sirve para romper células y darles un color transparente, se homogeniza.

 Agregar 150 mc de solución (III) se homogeniza.

 Se centrifuga a 12000 rpm durante 10 minutos.

 Se fenoliza (200 mc fenol y 200 mc cloroformo alcohol isoanilico 24: 1) se le agregaron 300 mc del sobrante, se centrifuga a 10000 rpm por 4 minutos.

 Se lavo con cloroformo (para arrastrar las trazas de fenol)

 Se precipita con 210 mc de isopropanol, se le agregan 150 mc del sobrante y se deja centrifugar a 11000 rpm durante 6 minutos.

 Se lava 2 veces con 500 ml de etanol al 70% frio.

 Se centrifuga a 8000 rpm por 3 minutos.

 Se saca de la centrifuga, se decanta y se pone a secar, antes

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