Preparación y análisis cualitativo de ADN plasmídico Preparación y análisis cualitativo de ADN plasmídico

INTRODUCCIÓN

El eje central del trabajo práctico son las bacterias. Éstas son seres vivos unicelulares cuyas células no tienen un núcleo diferenciado. La mayoría de ellas tienen un único cromosoma celular y algunas pueden también tener ADN plasmídico, moléculas extracromosómicas de ADN doble cadena que se encuentra de forma superenrollada. Éstos no son esenciales en la vida de las bacterias, sino que les proporciona ciertas ventajas en cuanto a aquellas que no los posean.

Por una parte, trabajaremos con el ADN cromosómico y, por otro lado, la molécula de interés será el ADN plasmídico, que extraeremos y lo analizaremos con ayuda de la electroforesis.

OBJETIVO

Un primer objetivo es, a través de distintos métodos, realizar la extracción de ADN cromosómico y por separado, extraer el ADN plasmídico de la bacteria Escherichia coli. Al ser una extracción y no una purificación, el producto final de ambos casos quedará enriquecido en otras sustancias. Además, si realizamos el proceso correctamente, debemos poder observar el ADN cromosómico enrollado en una varilla de madera por un efecto mecánico gracias a su longitud.

Luego, con la electroforesis, medir la calidad de la muestra de ADN plasmídico. Por último, determinar los pesos moleculares de las bandas observadas en el gel.

MATERIALES Y METODOLOGÍA

Para la extracción del ADN cromosómico fuimos sacando capa por capa todo lo que lo cubre, de manera cautelosa, tratando de evitar la ruptura del mismo. Primero se nos dio 1 tubo con bacterias resuspendidas en 2 ml de buffer Tris-HCl 50mM y Sacarosa 25%, colocamos el tubo en hielo y luego añadimos 0,8 ml de EDTA 0,25 M, mezclamos suavemente con una varilla. Posteriormente con la misma pipeta incorporamos 0,4 ml de lisozima (10 mg/ml) y volvimos a revolver, dejándolo después reposar por 10 minutos. A partir de acá volvimos a trabajar en temperatura ambiente. Agregamos 0,4 ml de Tritón X-100 (9% v/v), mezclamos con la varilla y dejamos otra vez reposar unos 30 minutos. Colocamos luego 0,4 ml de Acetato de Sodio 3M, mezclamos y transferimos a un vaso de precipitados. Por último, incorporamos a este recipiente, 10 mil de Etanol frío, que, al disminuir la polaridad del medio acuoso, permite que el ADN precipite. El ADN debido a su longitud, pudo enrollarse a la varilla que luego sumergimos en 5 ml de Etanol 70% (v/v) junto con agua. (La función de cada una de las sustancias están explicadas en el cuestionario, punto 1, cuestionario 1)

En cambio, la extracción del ADN plasmídico, se basa en el método de lisis alcalina, donde el objetivo principal, además de degradar las capas que cubren tanto al ADN plasmídico como el cromosómico, es la desnaturalización y renaturalización abrupta, ya que aquí se presenta la clave para separar estos dos tipos de ADN. Para esto utilizamos tres soluciones: “Solución de resuspensión”, “Solución de lisis alcalina” y “Solución de renaturalización” trabajadas en ese orden y cuyas funciones están explicadas en el cuestionario (punto 8, cuestionario 2), logrando entonces, la lisis de la bacteria, con ambos DNAs desnaturalizados. La separación de ambos está en el principio de separación “Renaturalización diferencial”, donde el ADN cromosómico se renaturaliza abruptamente, de manera no exitosa, al igual que las proteínas presentes, mientras que el ADN plasmídico se renaturaliza correctamente. Aquí centrifugamos, haciendo que el ADN cromosómico, las proteínas y los lípidos precipiten formando un pellet y quedando un sobrenadante de ADN plasmídico, ARN y sales. Luego, con la ayuda del isopropanol, el ADN plasmídico precipita debido a que este alcohol disminuye la polaridad del medio, haciendo que consecuentemente disminuyan las interacciones DNA-solvente. Volvemos a centrifugar una vez más para que el plasmídico precipitado forme un pellet, quedando un sobrenadante de sales, aunque algunas de ellas precipitan con el ADN, por lo que es necesario el lavado con Etanol 70% para aumentar la purificación y, posteriormente lo secamos para que no queden restos de Etanol. En el caso de nuestro grupo, tratamos el producto obtenido con RNAsas que degradaron el ARN que había precipitado junto con el ADN plasmídico.

La electroforesis en gel de agarosa se utiliza comúnmente para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma. Se trata de un medio de separación especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas.

Se realizó una solución de agarosa y (Agarosa 0.8%, Bromuro de etidio 10 mg/ml, TAE 1X y solución salina) y se la colocó en un horno de microondas. El bromuro de etidio (BrEt) es un compuesto aromático que al ser irradiado con luz UV (260nm) fluorece en el naranja (560nm). Su función, principalmente, es intercalarse entre las bases del ADN o ARN, y al intercalarse aumentar su fluorescencia 20 veces, permitiendo visualizar las bandas. La agarosa es un polímero natural, polisacárido formado por galactosas alfa y beta, que, al gelificar, impide la difusión del ADN. El TAE 1X es un buffer que mantiene la solución a pH 7 y actúa como conductor eléctrico ya que posee electrolitos. Se lo coloca en un horno de microondas para calentar la solución y de esa manera fundir la agarosa que está en estado sólido en forma de un polvo blanco. Luego, se volcó en un molde con un peine. Al enfriarse la solución se gelificó. Se retiró el molde y el peine quedando así definidos los pocillos o “calles” y se colocó en la cuba de electroforesis cubierto en su totalidad de buffer de corrida (Tris base 242 g, ácido Acético glacial 57,1 ml, EDTA 0.5 M pH 8 100 ml y H2O hasta 1 litro). Cabe aclarar que todo este proceso fue realizado por los docentes. Se comenzó la preparación de la muestra: un operario de nuestro grupo tomo 4 μl del ADN plasmídico extraído en el anterior trabajo y se lo incorporó a la solución de 2 μl de buffer de siembra (Xilene-cianol 0.1%, Azul de bromofenol 0.1% y Glicerol 15%). El buffer de siembra facilita la siembra de la muestra (al darle densidad y color). También da una idea del avance de la corrida, dado que los colorantes migran en el mismo sentido que el ADN: El Xilene-cianol (color celeste-turquesa) corre a la altura de un ADN lineal doble cadena de 5 kpb mientras que el azul de bromofenol (color azul-violeta) corre a la altura de un ADN de 500 pb. Luego de homogeneizar ambas soluciones cargando y descargando la pipeta, se procedió a insertar 4 µl de la nueva solución en nuestro pocillo correspondiente con extrema delicadeza. Aparte de nuestra muestra y la de los demás grupos, se sembraron marcadores de peso molecular, una muestra de ADN plasmídico realizada por los docentes, ADN linealizado y ADN plasmídico previamente digerido por alguna enzima de restricción. Por último, se hizo correr el voltaje durante alrededor de una hora y cuarenta minutos antes de detenerlo.

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