Reporte De Electroforesis Y Fotodocumentado.

Introducción

La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico.

Así pues, la electroforesis en gel es una técnica consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de un medio gelatinoso.

Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por ejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo (Westermeier, 1997).

La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica sencilla y rápida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse en el gel tiñendo con una concentración baja de bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se utiliza como colorante.

Objetivo

Realizar una electroforesis para visualizar el producto amplificado y documentar digitalmente los resultados.

Materiales y Métodos

Materiales: Se utilizó una pipeta eppendorf (o equivalente) de 2 - 20 µl, una punta estéril para pipeta de 2 - 20 µl, un matraz de 250 ml, un masking tape y una gradilla para tubos eppendorf de 1.5 ml.

Reactivos: Se utilizó un gramo de agarosa para uso de rutina Sigma A9539 o equivalente, 17.5g de bromuro de etidio (solución de 10 mg/ml) y 5µl de Marcador de peso molecular.

Equipo: Se utilizó para electroforesis; Unidad electroforética para minigel con peine de 12 pozos, una mini centrifuga de 6 plazas para tubos eppendorf de 1.5ml, una fuente de poder y un microondas. Para documentar digitalmente se utilizó un fotodocumentador de geles conectado a una computadora.

Métodos: Para preparar el gel de agarosa y para realizar la electroforesis es necesario preparar una solución amortiguadora de Tris-ácido acético-EDTA (TAE). Primero se prepara una solución concentrada (×50) y luego una solución diluida (×1). La fórmula de la solución concentrada es Tris 2 M, ácido acético 1 M y EDTA 0.05 M.

La solución diluida sirve para preparar los geles y llevar a cabo la electroforesis.

Una vez que los pozos están cargados, se agrega 15 µl de bromuro de etidio a la solución amortiguadora de la unidad. Se procede a cerrar la unidad electroforética y se conecta a una fuente de poder a 100 V por 30-45 minutos. Se debe de tomar en cuenta que el lado del gel que contiene los pozos superiores debe de ir en el polo negativo de la unidad electroforética. Una vez terminada la electroforesis, se enjuaga el gel con agua destilada para eliminar el exceso de bromuro de etidio. El gel se coloca dentro de la unidad de captura de imagen digital, que en nuestro caso fue una unidad MiniBis Pro. Las bandas productos de la amplificación por PCR son invisibles con luz blanca pero fácilmente detectables bajo la luz ultravioleta debido a la afinidad del bromuro de etidio hacia el ADN. Se captura la imagen con ayuda del software de la unidad fotodocumentadora.

Resultados

Se realizó un análisis cualitativo por medio de electroforesis y fotodocumentado de la extracción de ADN de las muestras de pollo, carne y plantas (FIG. 1)

Se efectuó también extracción de muestras de ostión y camarón pero no fueron visualizadas en el fotodocumentador debido a malos tratamientos de la muestra antes de la extracción.

En los carriles 1A-5ª (Fig.1 se muestra un barrido lo cual indica que el ADN de dichas extracciones esta degradado.

En los carriles 1B-5B (Fig.1) se muestra una banda de ADN clara por lo cual la extracción de ADN fue exitosa. La visualización que se muestran por debajo del ADN en los

...