TRABAJO PRÁCTICO: ESPECTROFOTOMETRÍA

TRABAJO PRÁCTICO: ESPECTROFOTOMETRÍA
nota: 8 (ocho)

ALUMNOS:

• Benzoni, Carla
• Graff, M. Victoria
• Izzo, Guadalupe
• Zapata, Sebastián
  

COMISIÓN: 2

JTP: Federico Monczor

AYUDANTES: Laura Fischerman; Florencia Scochera

AÑO: 2015 – 2º Cuatrimestre

OBJETIVOS:

 Primera Parte:

• Controlar y asegurar el buen funcionamiento de un espectrofotómetro.

Segunda parte:

• Calcular la concentración de proteínas de una solución empleando la reacción del Biuret como técnica espectrofotométrica.
• Cálculo de Absortividad de una muestra de Rojo Congo

FUNDAMENTOS:

La espectrofotometría nos permite, mediante la espectroscopia atómica y molecular, obtener información a partir del análisis de las distintas interacciones de las radiaciones electromagnéticas con la materia.
Una manera de conocer la concentración de una solución consiste en medir el efecto que dicha concentración tiene sobre la intensidad de un haz de luz luminoso que incide sobre ella.
Si se ilumina la solución con luz monocromática (luz de una sola longitud de onda) ocurrirá que parte de la intensidad de esa luz (Io) será absorbida por las moléculas que están en dicha solución (Ia), parte se refleja (Ir) y parte será transmitida (It) (si la incidencia del haz de luz es normal a la pared del tubo que contiene la solución, la luz reflejada será despreciable); para que se cumpla el principio de conservación de la energía:    Io = Ia + It, dividiendo todos los términos por Io, se obtiene la expresión: 1 = S + T; siendo S absorción y T  transmitancia.

La variación de la intensidad transmitida con respecto a la incidente es directamente proporcional al espesor del material interpuesto (l) y a una constante (k) propia de cada material, llamada coeficiente de absorción; de esto deriva la ley de Lambert, que dice que la intensidad de la luz monocromática transmitida decrece cuando el espesor del medio absorbente crece, y, por un desarrollo matemático análogo se obtuvo también la Ley de Lambert - Beer  It = Io. (donde a es una constante denominada absortividad; es propia de cada sustancia y depende de la longitud de onda, la temperatura y el solvente con que se trabaje) que dice que la intensidad de luz monocromática transmitida por la solución de una sustancia determinada decrece cuando su concentración aumenta (esta ley se cumple trabajando a bajas concentraciones y en presencia de luz monocromática). La ley de Lambert - Beer también permite establecer una relación entre transmitancia (T) y concentración aunque no existe una relación lineal entre ellas (la transmitancia decae en forma exponencial con la concentración); la absorbancia (Abs) que es  – logaritmo T es un nuevo parámetro y si se representa gráficamente Abs en función de la concentración, el gráfico mostrará una relación lineal entre las dos variables siempre que la sustancia utilizada cumpla con la ley de Lambert - Beer.
A partir de la ley de Lambert-Beer se pueden estudiar sustancias coloreadas en el visible aportando mucha información acerca de ellas; como instrumento de medición se utiliza un espectrofotómetro que determina transmitancia a partir de la medida de intensidad transmitida comparándola con la intensidad incidente; el espectrofotómetro posee dos tipos de tipos de escalas: la escala de transmitancia %, que es lineal y abarca de 0 a 100% y la escala de absorbancia que es logarítmica y abarca de 0 a .
Para informar un resultado confiable es necesario estar seguros de que el equipo utilizado funcione correctamente, por ello se realizan los controles espectrofotométricos que permiten controlar y analizar determinados parámetros y verificar si se encuentran dentro de los rangos de aceptabilidad establecidos.

Control de luz espuria: la luz espuria es toda la luz que llega al detector sin haber atravesado la muestra; puede presentarse una luz espuria accidental generado por errores del operador, por ejemplo si se cierra de manera errónea la tapa del espectrofotómetro e incide la luz espuria en el tubo con la muestra. Estos accidentes son detectados mediante filtros o soluciones opacas como una solución muy concentrada de colorante (contra una cubeta con agua, a  seleccionada dentro del visible). La luz espuria se mide en porcentaje de transmitancia y el máximo aceptado es 1%. Además de la luz espuria accidental existe la luz espuria parásita, que es la radiación electromagnética de longitud de onda distinta a la seleccionada que llega al detector, pasando o no por la muestra.

Control de volumen mínimo: Se considera volumen mínimo, al mínimo volumen contenido en una cubeta a partir del cual la lectura se estabiliza y no varía con el agregado de más líquido. Dicho control nos asegura que toda la luz pase por la solución y no pase por otro lado, lo que produciría resultados erróneos. Este control es importante también desde el punto de vista económico, para ahorrar en el uso de los reactivos.
Control de cubetas: Se realiza para determinar las cualidades ópticas y de construcción de las cubetas de medida. Se mide la T % de las cubetas con un volumen determinado de agua, tomando una como referencia y luego se verifica la desviación que tiene las demás cubetas con respecto a esta; la desviación debe ser menor al 1% de T.
Control de centro de banda: Dicho control se realiza para verificar la concordancia entre la longitud de onda fijada y la real (la que le llega a la muestra). Para realizar dicho control se realiza  un barrido espectral que consiste en medir la absorbancia de una sustancia  de referencia en diferentes longitudes de onda (el gráfico de Abs en función de longitud de onda constituye el espectro de absorción de la sustancia y es característico de cada una), la referencia tiene que presentar diferentes picos de absorción que deben ser estrechos y bien definidos, por lo tanto se tienen que conocer las longitudes de onda máxima. Si al realizar el barrido espectral la medición del valor de la longitud de onda correspondiente a la máxima absorción leída coincide con el valor de la referencia podremos asegurar que en esa zona el aparato trabaja a las longitudes de onda indicadas por el selector pudiendo trabajar con confianza en ese intervalo, en cambio si esto no sucede hay un corrimiento de la longitud de onda (en nm) y por lo tanto se tendrá que corregir dicho corrimiento para poder utilizar adecuadamente el equipo.

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