Materiales y métodos

Materiales y métodos

Hoy, se producen anticuerpos policlonales contra antígenos específicos, y luego utilizaron. Los anticuerpos son reactivos ampliamente empleado en los campos biológico para probar las proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos. Además, sintético y no de antígenos sintéticos son considerablemente producida por bioquímica biosintética recombinantes, y técnicas para provocar una respuesta inmunitaria específica. La mayoría de esos nuevos los antígenos son moléculas pequeñas y débiles inmunógenos así que necesitan ser adsorbidos en adyuvante.

En esta investigación, se usó polvo del factor VIII que fue agregado a un adyuvante: Hidróxido de aluminio con la composición de Al(OH)3 de 0,3 mM, 0,4 mM de NaCl, Na2HPO4 0,135 mM, NaH4PO2- H2O 0,135 mM, el volumen del frasco se hizo a 20 ml con tal solución adyuvante. Ellos fueron divididos en 500 ul en los tubos por igual.

Se tomó sangre de las orejas de 4 conejos antes de la inoculación del antígeno. Los días 1, 5, 14 días, 4000 ug/0,5 ml de antígeno del Factor VIII fue inyectado en 3 partes del cuerpo del conejo. Antes de cada inyección, fueron pesados y se controlaba la temperatura.

Las muestras de sangre fueron mantenidas en refrigeración durante 2 h para la coagulación. La sangre coagulada se separó del suero por centrifugación a 5000 rpm durante 5 min. El suero fue conservado en tubos Ependorf y almacenados a -20C. Los anticuerpos producidos se evaluaron  cualitativa y cuantitativamente mediante el empleo de técnicas como:

• la inmunodifusión
• hemaglutinación
• la inmunoelectroforesis.
• SDS-PAGE
• western blot
• dot blot
• ELISA

Inmunodifusión

Se hicieron dos pozos de inmunodifusión en gel de agarosa; antígeno y anticuerpo fueron añadidos a cada pocillo. Se mantiene a la temperatura del refrigerador en cámara húmeda durante 24 h. Se tiñeron con Azul de Coomassie. La presencia de zona manchada indico una reacción antígeno-anticuerpo (Fig. 1).

[pic 1]

Fig. 1 Inmunodifusión: en el orificio derecho de anticuerpo y antígeno en el orificio izquierdo se vierte. Presencia de la zona manchada indica una reacción entre el anticuerpo del factor VIII con su antígeno correspondiente

Inmunodifusión radial simple (SRID)

Se usó una placa Petri de 10 cm de diámetro donde se realizó la mezcla de Agarosa + el Antígeno de Factor VIII.

Anticuerpo fue diluido como 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 y 1/100000. La placa se mantuvo a temperatura refrigerada en cámara húmeda durante 24 h. La corona se formó a 1/1000 de la dilución  (Fig. 2)

[pic 2]

Fig. 2 inmunodifusión radial

Tinción

Soluciones de tinción contiene: 0,25 g de azul de Coomassie, 10 ml de ácido acético y 50 ml de metanol. Después de la mezcla, el volumen final fue hecho con 100 ml de agua destilada. El gel se mantuvo en la solución colorante durante 10 min. El exceso de mancha fue removido por solución de des tinción (metanol 50 ml, 50 ml de ácido acético bien mezclados, el volumen final fue hecha a 400 ml con agua destilada) durante 2 h.

Hemaglutinación

Se basa en una reacción entre el anticuerpo y el antígeno.

Hemaglutinación indirecta es cuando en lugar de partículas inertes se usan eritrocitos convenientemente tratados (hematies de carnero tanizados), como soporte de Ag (hematies sensibilizados), se efectúa en placa de microtitulación, con diluciones seriadas de los sueros y la lectura es similar a la de la aglutinación directa.

Esta prueba es un desarrollo directo de la prueba de Coombs que se usa para determinar Ac contra Ag de la superficie de los eritrocitos.

En esta investigacion el antígeno soluble está sensibilizada por reactivos como el ácido tánico, tripsina, glutaraldehído carbodeamide peryodato, etc., y está recubierto en los eritrocitos de oveja.  (Fig. 3).

[pic 3]

Fig. 3 Hemaglutinación de GR de ovejas: en filas horizontales fueron sangre de diferentes conejos y en filas verticales distintas diluciones seriadas del anticuerpo. La primera dilución en el pozo nº. 1, 1/20 pertenece a conejo el nº. 1 anticuerpo diluido en serie. Las series 2 y 3 se refiere a los conejos nº. 2 y 3. Conejo nº. 4 murieron durante el estudio. La última serie es el control negativo, es decir, sin Anticuerpos de suero de conejo.

La inmunoelectroforesis

La inmunoelectroforesis es una técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes componentes proteicos presentes en distintas muestras biológicas (suero, orina, etc) a través de arcos de precipitación.

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