EFECTO DE TRES FITOADITIVOS SOBRE LA REDUCCION DE METANO RUMINAL BAJO CONDICIONES IN VITRO.doc

FORMULARIO PROYECTO DE MEMORIA

Para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo

Presentado en el Departamento de: Producción Agrícola

Fecha: 24/09/2013

Apellido Paterno                        Apellido Materno                            Nombre (s)

     Roco                                       Méndez                Nicole

RUT

18.742.074-1

N° matrícula

280038680

Correo electrónico

nroco@ug.uchile.cl

Teléfono particular

28801706

Celular

91654397

Dirección/comuna

Independencia 1499

Firma alumno

NOMBRE (s)

FIRMA

Héctor Manterola Badilla, Ingeniero Agrónomo, M.S.. Profesor Titular

NOMBRE

FIRMA

 Héctor Uribe. Médico Veterinario, MSc., Ph. D.

NOMBRE

FIRMA

 (Indicar grado académico y nombre)

NOMBRE

FIRMA

(Indicar grado académico y nombre)

INTRODUCCIÓN

El metano es considerado uno de los principales gases de efecto invernadero, aunque no es el que se encuentra en mayor concentración, pero si es el que tiene un mayor impacto, debido a que tiene un efecto 23 veces de mayor potencial sobre el calentamiento que el dióxido de carbono, y un tiempo de vida de 10 años en la atmosfera, por lo que el incremento de sus emisiones es de real importancia en el manejo del medioambiente. La formación de este compuesto se debe en gran medida a las actividades antropogénicas,  como la ganadería o la producción con rumiantes en general (Solomon et al., 2007).

Los rumiantes tienen la capacidad de aprovechar el contenido de celulosa de la fibra del forraje, mediante este proceso digestivo anaeróbico, las bacterias ruminales degradan la celulosa a glucosa, luego a acido acético. La via del acetato produce un incremento de protones en el rumen, los cuales son captados por el dióxido de carbono producido durante la degradación de los nutrientes. Como desecho metabolico de las bacterias metanogénicas se produce metano, lo que impide un descenso del pH en el rumen producto del aumento de protones, el cual produciría una acidosis. (Montenegro y Abarca,  ; McAllister, 1996)

El metano ruminal se forma a partir de la fermentación de los carbohidratos provenientes de las dietas altas en forrajes,  como producto metabólico final de los procesos digestivos de los microorganismos en la metanogénesis. La vía del acetato produce un incremento de protones en el rumen, los cuales son captados por los grupos metilos del acetato, impidiendo un descenso del pH rumen que puede provocar una acidosis. (McAllister, 1996).

Como resultado de la disminución de la formación de metano, se obtendrían mejoras en la calidad del medioambiente y un beneficio económico,  ya que este proceso implica una pérdida de entre un 2 a 12% de la energía bruta de la dieta consumida por el animal (Johnson y Johnson, 1995), lo que significa es que se podría aumentar la eficiencia en la conversión del alimento al producto final.

Debido a la importancia del metano, se han buscado métodos con el que se pueda reducir su emisión a la atmosfera, utilizando extractos vegetales o plantas que contengan componentes bioactivos, como las saponinas, taninos, aceites esenciales, etc.; que produzcan un efecto en la fermentación ruminal. En el caso de los taninos, se ha identificado el efecto sobre la reducción en el  número de protozoo, un efecto toxico sobre los microorganismos metanogénicos en el rumen, y  una desactivación de las enzimas proteolíticas, al igual que los aceites esenciales que presentan un efecto toxico frente  la población metanogénica. (Cieslak, A.; et al, 2013)

Para los efectos de este ensayo, se utilizaran tres fitoaditivos: corteza de quebracho, orujo de uva y orégano; en que el compuesto activo de la corteza de quebracho es tanino condensado y el orujo es el tanino hidrolizable, y en el orégano los aceites esenciales timol y carvacrol (Tekeli, et al., 2007).

Hipótesis

-La adición de cantidades crecientes de corteza de quebracho u orujo de uva u orégano a fermentación in vitro con licor ruminal, provoca reducciones significativas en la emisión de metano.

Objetivo

-Determinar el potencial de reducción de metano in vitro del orégano, orujo de uva y corteza de quebracho y sus efectos a distintos niveles de inclusión.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se llevará a cabo en la Estación Experimental del Campus Antumapu de la Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad de Chile, Santiago (33°57´ latitud Sur y 70°63´ longitud Oeste), en el Laboratorio de Nutrición Animal, del Departamento de Producción Animal, entre los meses Julio y Septiembre del 2014.

Materiales

-Animales

Se utilizarán 4 capones de raza Merino fistulados en el rumen, los cuales serán utilizados como donadores para obtener licor ruminal.

Serán alimentados con una dieta a base de heno de alfalfa para estandarizar las características del licor ruminal a utilizar.

-Corrales

 Los animales están en corrales individuales, provistos cada uno de comedero y bebedero y un sombreadero y protección de la lluvia.  Disponen de un pequeño patio de cemento y un patio de tierra.

-Fitoaditivos

 Se dispone de Orujo de uva, variedad Merlot,  Corteza de Quebracho y Orégano.

-Orujo de uva (Vitis vinífera): obtenido de una fermentación de vino tinto variedad Merlot de una viña. Contiene alrededor de un 10% de taninos hidrolizables

-Corteza de quebracho (Schinopsis balansae): aportado por VETERQUIMICA. Contiene una alta concentración de taninos condensados, un 80%

-Orégano (Origanum vulgare L.): adquirido en mercado de frutos del país. Posee aceites esenciales en un 5%, el que corresponde al timol en un 2.45% y al carvacrol con un 79.58% (Calsamiglia, Castillejos, Busquet; 2005).

-Tubos de incubación

 Se dispone de 45 tubos de incubación, de vidrio, de 100 cc y provistos de tapón de goma con aguja de jeringa que permite la salida parcial de gases pero no la entrada de aire.

-Buffer

 Se adicionará 50 cc. a cada tubo de incubación para mantener estabilizada la fermentación a un pH de 6.8.

-Estufa de cultivo 

 Para mantener los tubos a 39°C.

-Medidor de metano Eagle 2 

Mide la concentración de  metano en ppm.

-pHmetro 

 Para medir pH en el buffer.

Metodología

Se realizarán tres ensayos en condiciones in vitro, simulando las condiciones presentes dentro del rumen de un animal utilizando los tubos de incubación. El licor ruminal a utilizar se extraerá de los  4 capones fistulados conformando un pool de licor ruminal. Para ello, en la mañana, previo a dar alimentación,  se extraerá el contenido ruminal de cada uno y se filtrará con pañal y se almacenará en termo para mantener temperatura a 39°C.  

En cada tubo previo a agregar el licor ruminal, se colocarán las cantidades calculadas del fitoaditivo correspondiente con 5 repeticiones por cada aditivo y control.  Además se adicionará el buffer para mantener el pH constante en 6,8 en cantidad de 50 cc por cada tubo. Posteriormente se agregarán 15 cc de licor ruminal y se colocarán los tubos a incubación por seis horas a 39°C en estufa de cultivo.  Cada hora a partir del tiempo 0, durante 6 hrs, se hará mediciones de metano utilizando el determinador de metano Eagle 2  que da resultados en partes por millón (ppm). El tiempo de incubación se debe a que existe un periodo de acostumbramiento y crecimiento poblacional de los microorganismos, por lo que los efectos se observan alrededor de la tercera hora de incubación.

Los fitoaditivos a los cuales se les medirán el efecto sobre la formación de metano, la corteza de quebracho, orujo de uva y orégano; son secados en un horno hasta llegar a un peso constante, cuando ya perdieron su humedad. Se someterán a proceso de molienda a 1 mm. Posteriormente se colocaran los fitoaditivos en los distintos tubos de ensayo, de acuerdo a cada tratamiento.

Tratamientos

Se establecerán  cinco  tratamientos con cinco  repeticiones  cada uno, un TB, T0, T1, T2 y T3; y cinco repeticiones, en que el TB corresponderá al tratamiento basal que contiene solo 15 cc de  licor ruminal más 50 cc del  buffer. Los demás tratamientos (T0, T1, T2 y T3) tendrán como base una muestra ruminal, el buffer, más un sustrato de fermentación que consta de 0.5 gr de afrecho de soya y 0.5 gr de heno de alfalfa, el afrecho y el heno aportaran la energía y proteínas que requieren las bacterias ruminales. Al T1 además del contenido base, se le agregará 0.25 gr del fitoaditivo; al T2 se le agregará 0.50 gr y a T3 0.75g. Las diferencias en la inclusión de cada fitoaditivo en los tratamientos se deben a que se busca determinar de manera exploratoria el posible potencial que tiene cada uno  para disminuir la emisión de metano.

Tratamientos

TB: Licor ruminal + buffer

TO: Licor ruminal + buffer + 0.5 gr afrecho soya + 0.5 gr heno alfalfa

T1: Licor ruminal + buffer + 0.5 gr afrecho soya + 0.5 gr heno alfalfa +0.25 gr. aditivo

T2: Licor ruminal + buffer + 0.5 gr afrecho soya + 0.5 gr heno alfalfa + 0.50 gr. aditivo

T3: Licor ruminal + buffer +0.5 gr afrecho soya + 0.5 gr heno alfalfa + 0.75 gr aditivo

El número de incubaciones por cada  fitoaditivo que se realizará va a depender de las variaciones que hayan entre estas, de modo de reducir el error experimental.

Las cantidades de los distintos elementos que se incubarán han sido obtenidas de trabajos de diferentes autores, además de las experiencias realizadas previamente dentro del  proyecto “Desarrollo de fitoaditivos reductores de metano y amoniaco para mejorar la productividad y competitividad de los sistemas lecheros”, a cargo del profesor Héctor Manterola. Las distintas inclusiones de los aditivos  se utilizarán para establecer si existe un efecto de cada  fitoaditivo, y si este varía de acuerdo a las distintas concentraciones.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para el análisis de los datos, el diseño estadístico para cada ensayo corresponderá a un diseño completamente al azar con medidas repetidas, en el que se medirá la cantidad de metano emitida en los cinco tratamientos, con cinco repeticiones cada uno por cada medición.  La unidad muestreal será los tubos de incubación. Las diferencias entre los tratamientos se cuantificarán a través de un Análisis de Varianza usando un modelo para datos longitudinales, ya que al utilizar un mismo tubo para realizar las mediciones de las variables en el tiempo en más de una ocasión, estas estarán correlacionadas. Al considerar esta correlación se evita violar el supuesto estadístico de la independencia de las observaciones, además se deberán verificar los supuestos de normalidad de los datos a través de la prueba de Shapiro-Wilks y la homogeneidad de las varianzas con el test de Levene. A través del Análisis de Varianza se determinará si existe un efecto del tratamiento a utilizar y se establecerán regresiones entre las concentraciones del fitoaditivo y las concentraciones de metano generadas, comparándose las pendientes de las curvas de cada uno de los tres ensayos.

El modelo estadístico a utilizar para el ensayo será:

            Yijkl = µ + Ʈi + Hj + ƮHij + tubok (Ʈi) + Ɛijkl

                  donde:

Yijkl = es la concentración de metano de la l-ésima muestra del k-ésimo tubo   tomada en la j-ésima hora de muestreo del i-ésimo tratamiento.

Ʈi = es el efecto fijo del i-ésimo tratamiento (i= 1, 2, 3, 4, 5).

Hj= es el efecto fijo de la j-ésima hora de muestreo (j= 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6).

ƮHij= es el efecto fijo de la interacción entre el i-ésimo tratamiento y la j-ésima hora de muestreo.

tubok (Ʈi)= efecto fijo del k-ésimo tubo anidado dentro del i-ésimo tratamiento

Ɛijkl= residual aleatorio.

CARTA GANTT DEL PLAN DE TRABAJO