Laboratorio

ANEXO-Laboratorio Nº 1

OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS.

El examen microscópico de microorganismos constituye una de las técnicas características de la microbiología y aunque es posible observar ciertos microorganismos sin colorear (Ej. protozoarios), en el caso de las bacterias se hace necesaria la coloración de los preparados para aumentar el contraste con el fondo.

Para obtener el máximo aprovechamiento de la observación microscópica, debe poder relacionarse el comportamiento tintorial con la estructura y composición química de las diferentes partes de la anatomía bacteriana.

Colorantes y mordientes.

Los colorantes utilizados en Microbiología son compuestos orgánicos que contienen grupos cromóforos y auxocromos unidos a anillos aromáticos .

La presencia de grupos cromóforos en una molécula (grupos azo, nitro, etc.) no es suficiente para que ésta actúe como colorante, esto es que se fije a las estructuras a colorear. Para ser colorante debe poseer grupos que sean capaces de disociarse llamados auxocromos. Por ejemplo el 1,3,5 trinitrobenceno, es un compuesto coloreado pero no es un colorante. Sin embargo, si se reemplaza un H por un OH en el anillo bencénico, se obtiene el ácido pícrico que también es coloreado pero al poseer un grupo disociable (auxocromo) actúa como colorante.

La distinción entre colorantes ácidos y básicos depende de la carga de la parte de la molécula responsable del color. Si es negativa se trata de un colorante ácido y si es positiva se trata de un colorante básico. Esta diferencia es importante debido a que, según sean ácidos o básicos, los colorantes tendrán afinidad por diferentes zonas de la anatomía celular.

Algunos colorantes utilizados comúnmente en Microbiología son fucsina básica, cristal violeta, safranina, azul de metileno, etc.

En algunas coloraciones se utilizan sustancias capaces de formar complejos insolubles con los colorantes y que ayudan al proceso de coloración: los mordientes. Ejemplos de mordientes comúnmente usados son el Lugol, el ácido tánico y algunas sales.

Lógicamente, es de esperar que el colorante imparta su color a las estructuras celulares, sin embargo hay un fenómeno llamado metacromacia en el cual se observa un color diferente. Por ejemplo, pueden visualizarse corpúsculos metacromáticos rojos en ciertos preparados teñidos con azul de metileno. Una explicación que da cuenta de este fenómeno se muestra en la figura. El colorante, al interaccionar con ciertas estructuras polianiónicas como los polifosfatos, se dispone de tal manera que cambia la longitud de onda de absorción . Pueden observarse corpúsculos metacromáticos (gránulos de volutina) en varios géneros microbianos y en general, su presencia denota algún déficit nutricional en el medio de cultivo.

PREPARADOS PARA MICROSCOPIA OPTICA. PROCEDIMIENTO GENERAL.

Los pasos fundamentales previos a una coloración son: extendido, secado y fijado.

a) Extendido: se coloca una pequeña porción de la muestra en un portaobjetos y se extiende con el ansa en forma de óvalo. Para muestras provenientes de medios sólidos, debe colocarse previamente una gota de agua sobre el portaobajetos.

b) Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o colocar a 30-40 cm sobre la llama del mechero.

c) Fijado: la fijación tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la coloración así como también preservar la forma original de los microorganismos.

El procedimiento más común es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta técnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos más suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetróxido de osmio, ácido pícrico, etc.

Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloración, los preparados pueden contener microorganismos viables, en especial si hay esporos. Por consiguiente siempre deben considerarse como potencialmente riesgosos y manejarse con precaución.

Observación en fresco y coloración vital.

Cuando se desea observar bacterias sin afectar su viabilidad, puede realizarse una observación en fresco (sin colorear) o utilizar colorantes diluídos como por ejemplo cristal violeta 1/5000. Con esta técnica podrá observarse la morfología y agrupación de las bacterias así como también la movilidad.

Observación en fresco.

Técnica.

1- Sobre un portaobjetos colocar con el ansa una gota de agua y realizar una suspensión de la muestra en estudio. No extender.

2- Colocar un cubreobjetos.

3- Observar con poca luz.

Coloración vital.

El procedimiento es similar al de la observación en fresco pero en el paso 1, se coloca una gota de solución diluída de colorante en lugar del agua.

Existen portaobjetos especiales para realizar estas observaciones en los cuales es posible colocar una mayor cantidad de líquido. Son los portaobjetos de Boettcher y de Ranvier.

Coloración simple.

Esta coloración permite la observación de la morfología y agrupación de los microorganismos. Se realiza con un solo colorante. Entre los colorantes más utilizados para realizar coloraciones simples podemos nombrar el cristal violeta y el azul de metileno. En general se utilizan en soluciones acuosas al 1 %.

Técnica.

1- Extender, secar y fijar por calor.

2- Aplicar solución de colorante durante alrededor de 2 minutos. En general, el tiempo de la coloración depende de la concentración y del colorante utilizado.

3- Lavar con agua corriente.

4- Secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.

Tinción negativa.

Para esta coloración, se utilizan sustancias que no penetran en la célula y por lo tanto se tiñe el fondo quedando los microorganismos incoloros. Normalmente el tamaño de las bacterias observadas por esta técnica es mayor que el real y no debe utilizarse para la medición de microorganismos.

Los agentes más utilizados son la nigrosina y la tinta china y los microorganismos quedan incluidos en el colorante que forma una capa relativamente gruesa.

Con este método pueden observarse morfología y agrupación así como también estraucturas extracelulares como la cápsula.

Técnica.

1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un ansa, una gota de una solución acuosa de nigrosina al 10 %.

2- Tomar una porción

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