Acción Enzimatica De La Amilasa

ACCIÓN ENZIMATICA SEGÚN EL SUSTRATO

RESUMEN: Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran las velocidades de las reacciones, tienen una temperatura y pH optimo en la que su actividad es máxima, es por esto que su funcionamiento se ven afectado al cambio de estos dos factores, incluso si la temperatura llega a subir a un nivel extremo puede desnaturalizar a la enzima de forma irreversible. Mediante un test colorimétrico con Lugol y almidón se midieron las absorbancias de cinco muestras a diferentes concentraciones y se construyó una curva de calibración, con la que se pudo corroborar, que se cumplía la ley de Lambert –Beer. Observamos también la actividad enzimática α-amilasa salival sobre el almidón, según la desaparición de sustrato medido a través de la absorbancia con un espectrofotómetro, a diferentes temperaturas. Se comprobó empíricamente que se cumple la teoría; de que la temperatura afecta a la velocidad de las reacciones. Y mediante el proceso de elaboración de los experimentos, se hicieron explícitos los errores que afectan a los resultados. La α-amilasa en una enzima de tipo compleja, pancreática requiere del cofactor ión calcio.

Palabras clave: Actividad enzimática, catalizadores, termolabilidad y hidrólisis.

INTRODUCCION

Las enzimas catalizan todas las reacciones biológicas, incrementando la velocidad de las reacciones, casi todas son proteicas y requieren de un grupo prostético que le confiere una función en especial.

Los cofactores son pequeñas moléculas orgánicas esenciales para la catálisis por ejemplo la α-amilasa pancreática requiere de el cofactor aniónico del ion cloruro y la α-amilasa salival del ión calcio.

Las coenzimas son casi siempre derivadas de una vitamina y algunas están tan unidas a la porción proteica de la enzima que se puede desnaturalizar si se las separa. (Montgomery, 1999)

La α-amilasa salival o llamada también ptialina, es producida por la glándula parótida, esta rompe de dos en dos, los enlaces α-1,4 de la estructura del almidón resultando en disacáridos maltosa. Pero su acción es de corta duración. El pH óptimo de la α-amilasa salival es cercano a 7, es por esto que cuando el bolo alimenticio llega al estomago su actividad se suspende. (Peña, 2004)

Esto se explica porque el pH del estomago al ser más acido afecta al estado iónico de la enzima debido al carácter proteico que esta tiene afectando así a su función.

Otro factor que afecta a la función enzimática es la temperatura, la que al subir va a acelerar la reacción hasta llegar a un punto en que se producirá la desnaturalización, la cual es irreversible, esto ocurre en la mayoría de las enzimas, por lo tanto cada enzima tiene un pH y una temperatura optima en la que su actividad es máxima.

La α-amilasa es de tipo hidrolasa que catalizan la escisión de enlaces entre un átomo de carbono y otro átomo por adición de agua. (Montgomery, 1999)

Además las enzimas poseen un sitio catalítico activo donde la porción específica del sustrato se ajusta para que se produzca la hidrolisis del enlace.

Seguiremos la reacción de la enzima α-amilasa salival detectando la desaparición de sustrato mediante un test colorimétrico con Lugol para determinar la presencia de almidón, el cual posee una estructura helicoidal de la amilosa donde ingresa el Lugol dando una coloración azul intensa. Por lo tanto si la α-amilasa salival hidroliza a la amilosa no dará esta coloración.

MATERIALES

1.- 1 Gradilla

2.- 10 tubos de ensayo

3.- 2 Micropipetas

4.- 3 vasos de precipitado (200µl y 1000µl)

5.- 3 vasos de precipitado (50ml o 100ml)

6.- Baño de hielo (0°C)

7.- Baño termoregulado (90°C)

8.- Estufa (37°C)

9.- 1 cubeta para epectrofometría

10.- Espectrofotometro

11.- Solución de Lugol

12.- Solución de almidón (2%)

13.- Agua destilada

14.- Saliva humana

15.- Solución salina fisiológica (0,9%)

PROCEDIMIENTO

Se recolecto 5 ml de saliva, la cual se diluyo con suero fisiológico hasta completar 15 ml.

Experimento 1:

Se tomaron 5 tubos y se les agregó almidón al 2% (según a tabla) más 500 ul de lugol y se agregó agua destilada para completar el volumen final de 5ml.

Se espero 5 minutos para ver si ocurría alguna reacción después se calibro el espectrofotómetro usando como base la muestra blanco, se midió la absorbancia obtenida de cada una de las muestras y se construyó una curva de calibración.

Experimento 2:

Se tomaron 2 tubos de ensayo y se le agregaron a cada uno 3000 ul de almidón al 2 %, se colocaron en un baño térmico por 2 minutos a 37°C.

Al primero se le agregó 1000 ul de saliva diluida y al segundo se le agregó suero fisiológico, se mesclaron suavemente e incubaron por 10 minutos, luego de este tiempo se les agregó 500 ul de lugol y se determinaron sus absorbancias 678 u.a y 1926 u.a. respectivamente.

Experimento 3

Se tomaron 4 tubos y se le agregaron 1000 ul a cada uno de saliva y se sometieron a diferentes temperaturas por 5 minutos; el primer tubo a 0° grados, el segundo tubo a temperatura ambiente y el tercero y el cuarto a 37° y 90° grados respectivamente.

Al terminar el transcurso del tiempo de exposición, se le agregó a cada uno 3000 ul de almidón al 2%, se mezclo e incubo por 10 minutos y añadió 500 ul de lugol y finalmente se midieron sus absorbancias

RESULTADOS

Tabla 1. Experimento 1. Absorbancias obtenidas en base a las concentraciones dadas

T Almidón

2% (μl) [ ] % Lugol

(I2/K) (μl) HO2

(μl) Total

(μl) Absorbancia

(u.a)

I 0 0,00 500 4500 3000 0

II 250 0,10 500 4250 3000 0,129

III 1,250 0,50 500 3250 3000 0,427

IV 2,500 1,00 500 2000 3000 0,896

V 3,750 1,50 500 750 3000 1,324

Figura 1: Experimento 1, curva de calibración de las absorbancias.

En la tabla 1 se realizó una tabla en base a las concentración de cada tuvo y la absorbancia presentada en proporción a su concentración, obteniendo mayor absorbancia en concentraciones de mayores de almidón, luego en base a los resultados se realizó una linealización, en donde indica que la absorbancia aumenta en forma lineal con la concentración (con un paso

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