BIOLOGÍA MOLECULAR AVANZADA

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Primer Examen Parcial

BIOLOGÍA MOLECULAR AVANZADA

NOMBRE__Maria Isabel Sanchez Espinosa __________________________________________________________   FECHA_______13/10/2020_____

La siguiente secuencia corresponde a una proteína sensora de calcio de 1243 bp. Analiza la secuencia y contesta lo siguiente:

1. Localiza el sitio único de corte con la enzima   BfaI   C▼TA▲G   coloréalo  CTAG

1.1 ¿Cuántos fragmentos se obtienen de ésta restricción y de qué tamaño son?

Son 2 fragmentos el primero es de 1019 bases y el segundo es de   224 bases

1.2 ¿Qué tipo de extremos produce? Extremos cohesivo 

Menciona ¿en cuál hebra se hace el corte? 5' ext. - 3'

2. Localiza los dos sitios de corte con la enzima EcoRI  G▼AATT▲C   coloréalos GAATTC

2.1 ¿Cuántos fragmentos se generen con ésta enzima? y ¿de qué tamaño son?  

Son 3 fragmentos el primero es de 832 bases, 387 bases y 24 bases

2.2 Define una unidad de enzima

Se define como una unidad de enzima que necesita para cortar 1 microgramo de DNA en 1 hr

3. ¿Cuántos fragmentos y de que tamaño son si hago un coctail de las enzimas antes mencionadas?

 Son 4 fragmentos  el primero es de 832, 187 bases, 200 bases y 24 bases

3.1 Dibuja las bandas que se generaron de la restricción en los puntos 1, 2, y 3 utilizando el marcador de peso molecular.  (incluido en este documento. Para cada caso un carril diferente)

4. Imagina que vas a clonar la secuencia completa en un plásmido cuyo reportero es el gen lacZ (esquema). La secuencia está flanqueada por las enzimas XmaI

   4.1 Enumera los pasos para hacer la clonación

1. Primero debemos identificar el gen de nuestro interés
2. Debemos cortar el gen con las enzimas  de restricción que en este caso es la enzima Xmal
3. Una vez cortado nuestro gen de interés se debe ocupar una enzima para poder sellarlo  a nuestro vector que es el papel de la ligasa, todo esto ocurre en nuestro sitio de clonación múltiple que se encuentra en nuestro gen de interés
4. Una vez concluido con nuestro vector necesitamos de una célula huésped para que esta pueda auto-replicarse
5. Se necesita de un método de transformación en el que comúnmente se utiliza el choque de calor, en este proceso es donde la bacteria absorbe a nuestro vector que en este caso es nuestro plásmido
6. Se debe crear un medio en el que le beneficiara a nuestra celula en la que contendrá los antibióticos que necesita y nutrientes
7. Obtencion de colonias
8. Se tiene que hacer una selección de bacterias que dieron positivo a nuestra clonación
9. Se toma una muestra de la colonia  y hacemos una replicación con nuestros nutrientes para hacer mas clones y sea para una producción eficiente

   4.2 ¿Qué métodos se usan para transformar?

  El que comúnmente se ocupa es el de choque de calor ya que es considerado efectivo y económico,

   4.3 ¿Cómo vas a evaluar si las colonias que obtienes son positivas?[pic 1]

[pic 2]

4.4 Explica ¿cómo compruebo si el fragmento de interés está clonado? Sustenta la explicación de acuerdo a los elementos del plásmido del esquema incluido (el punto anterior y éste lo debes de contestar analizando el plásmido)  

Primero debemos considerar  que todos los plasmidos tienen un origen de replicación también contienen un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibióticos específicos, aquí juega el papel de la enzima xmal que es una enzima que corta ADN y que reconoce sitios específicos de nuestro plasmido . En este caso  se inserta  nuestro Fragmento dentro del gen de resistencia a lacZ  en donde se localizan los sitios de enzimas de restricción que cortaran el plásmido y se unirá nuestro fragmento  con la  enzima ligasa . Una vez insertado un fragmento de DNA se producirá una inactivación se deberán introducir en nuestra celula huésped  una vez que estas contengan el pUC18 formaran colonias de tonalidad azul cuando crecen en un medio que contiene X-gal. Si hay DNA insertado en el sitio de clonación múltiple, se interrumpe el gen lacZ y se forman colonias blancas. Las colonias blancas, resistentes a ampicilina, contienen plásmidos con DNA insertado.

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