Bioquimica (ovolumina)

INTRODUCCIÓN

La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara de huevo (60-65% del peso de la clara de huevo). Pertenece a la súper familia proteínica de las serpinas, aunque a diferencia de la mayoría de éstas la ovoalbúmina no es capaz e inhibir cualquier peptidasa. La función biológica de la ovoalbúmina es desconocida, aunque se presume que sea una reserva de proteínas para la cría del ave. Otros autores señalan la capacidad que posee la ovoalbúmina de anular los enzimas digestivos y por ésta razón señalan que es un mecanismo protector contra las bacterias exteriores agresores al huevo.

     OBJETIVOS

• Averiguar la concentración de la ovoalbúmina por fotocolorimetria.
• Adquirir destreza en el manejo del fotocolorímetro y en la manipulación del material biológico y de laboratorio.

CUANTIFICACIÓN DE LA OVOALBÚMINA MEDIANTE EL FOTOCOLORÍMETRO MERK SQ 118

. MÉTODO COLORIMÉTRICO

  El método fotocolorímetro es el método óptico de absorción molecular que nos permite cuantificar sustancias y está basado en la medida de la intensidad de la luz monocromática, transmitida a través de soluciones coloreadas, sean que se trata de sustancias naturalmente coloreadas o que se han hecho de tal calidad mediante reacciones químicas adecuadas.

La mayoría de los cuerpos en soluciones tienen una capacidad de absorción selectiva sobre determinadas radiaciones luminosas, cuando se realizan en la zona espectral visible, aparecen a la vista del observador de un color que es producido por radiaciones que no han sido absorbidas.

[pic 1]

Si se considera que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la intensidad de la luz transmitida de la luz incide una corriente eléctrica proporcional por una solución disminuye en relación con el número de moléculas que se interpongan entre la fase luminosa y el observador. éste número varía de acuerdo a la concentración y al espesor del recipiente que contenga la muestra. Estos factores están considerados en la ley de Lambert-Beer que rigen los principios de la fotocolorimetría.

[pic 2]

• FUNDAMENTO

Ciertas moléculas por acción de la luz generan una corriente eléctrica proporcional a la intensidad de la luz que es pequeña y puede ser detectada por una célula fotoeléctrica.

Cuando una célula fotoeléctrica recibe un haz de luz transmitida a través de agua destilada (de densidad óptica = 0), produce una corriente eléctrica de potencial determinado que puede medirse con un galvanómetro, reemplazamos esta con una solución coloreada, aumenta la densidad óptica y disminuye la intensidad de la luz transmitida, al mismo tiempo se produce una caída de potencial que es la que se registra en el galvanómetro.

En los fotocolorímetros se efectúa una selección de la longitud de onda en la que se produce la mayor absorción mediante el uso de filtros adecuados y en el caso del espectrofométro los filtros son reemplazados por un prisma que descompone el espectro de la luz blanca. Para eliminar el factor que depende del espesor del recipiente se usan tubos especiales de diámetro estándar.

Medida de la densidad óptima (D.O)

Las soluciones se leen en una escala expresada en unidades logarítmicas que van del 0.000 al 2.000, al cero corresponden al 100% de tramitancia es decir a una absorción igual a cero y al 2000 corresponde a una absorción del 100% y no se transmite la luz. En el caso de fotocolorímetro Klett Summerson.

Las unidades de la escala equivalen a multiplicar la D.O por 500, así una lectura de U.K corresponderá a una D.O = 2.00

[pic 3]

• CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA MUESTRA

Para calcula la concentración que tiene la muestra problema se puede usar dos métodos:

A) MÉTODO DE FACTOR CALIBRACIÓN

Se conoce como factor de calibración a la cantidad de una sustancia (En peso) de concentración conocida que corresponde a una lectura del fotocolorímetro. Se obtiene dividiendo la concentración del estándar.

 [pic 4]

DONDE:

FC= Factor de calibración.

(St)= Concentración del estándar.

L= Lectura del estándar de D.O

B) MÉTODO DE LA CURVA DE ABSORCIÓN

Este método consiste en utilizar varios estándares de concentración progresiva y construir una gráfica en un sistema de coordenadas en las que se colocan las lecturas en el eje de las ordenadas (eje de la Y, que es un eje vertical) y las concentraciones en el eje de las abscisas (coincide con la línea horizontal).

Por ejemplo: Preparamos una serie de estándares de 1.2.4.6.7.8 mg % y nos dan lecturas de 0.040, 0.079; 0.062; 0.313 y 0.380 respectivamente, con éstos datos podemos construir una gráfica curva de absorción.

[pic 5]

• LEY DE LAMBERT BEER

Es de mucha utilidad en el laboratorio bioquímico porque relaciona la concentración de la misma.

A=a x b x c

DONDE:

A: Absorbancia

a: Absortividad específica (Depende la sustancia y la longitud de onda)

b: Camino óptico (Longitud de solución que la luz debe atravesar)

c: Concentración del absorbente.

También se utiliza el coeficiente de extinción (ε) como la absorbancia de una solución molar (1M) de un absorbente, a una longitud de onda (λ) y con un paso de luz de 1cm. [pic 6]

ABSORBANCIA

Cuando  un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esta luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz será transmitida por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y la transmitancia son dos aspectos del mismo fenómeno. La absorbancia, a una determinada longitud de onda lambda, se define como:[pic 7]

Donde:

 I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida)

 I0 es la intensidad de la luz incidente.

TRANSMITANCIA

Se define como la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en determinada cantidad de tiempo.

Existen varios tipos de transmitancia, dependiendo de qué tipo de energía consideremos.

La transmitancia óptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en una determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra fracción de ese haz de luz atraversará el cuerpo, según su transmitancia. El valor de la transmitancia óptica de un objeto se puede determinar según la siguiente expresión:

[pic 8]

I es la cantidad de luz transmitida por la muestra  e I0 es la cantidad total de luz incidente.

Muchas veces encontraremos la transmitancia expresada en porcentaje, según la fórmula:

[pic 9]

• CONCENTRACIÓN DE EXTINCIÓN MOLAR

Si l es un cm y c es I mol/L: La absorbancia sería igual al coeficiente molar de extinción (K). El cual es característico para un compuesto dado. El coeficiente molar de extinción producida por I mol /L en un recorrido de la luz de 1cm.

• CONCENTRACIÓN DE EXTINCIÓN ESPECÍFICA

No se puede conocer fácilmente el peso molecular de algunos compuestos tales como proteínas y ácidos nucleicos presentes en una mezcla y en éste caso se usa éste coeficiente.

Este se define como la extinción de 10gr /L del compuesto en un recorrido de 1cm. [pic 10]

• LIMITACIONES DE LA LEY DE LAMBERT- BEER

Algunas veces no son lineales los gráficos de extinción en función de la concentración y esto se debe probablemente a que no se cumple algunas de las siguientes condiciones.

La luz debe ser de preferencia monocromática o La longitud de onda debe estar entre límites muy estrechos.

La longitud de onda de luz empleada debe coincidir con el máximo de absorción de la solución.

No debe hacer ionización, asociación, disociación, o solvatación del soluto con respecto a la concentración de él mismo.

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