Calculo de la Actividad enzimática de la Ureasa Oscar Javier Montiel1*, Dagoberto Ortiz Ome1*, Mateo Bolaños1*

Calculo de la Actividad enzimática de la Ureasa

Oscar Javier Montiel1*, Dagoberto Ortiz Ome1*, Mateo Bolaños1*

1*Estudiantes del programa de química, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad de la Amazonia. Florencia (Caquetá) 2017

Resumen

Se determinó la actividad enzimática de la  ureasa, enzima principal de la Harina  de Soya, a través de Espectrofotometría UV; Se realizó el análisis de la dependencia de la velocidad de reacción en función de la cantidad enzimática (composición), de la temperatura y del pH. Así mismo, se analizó la especificidad de la acción enzimática, empleando la presencia de ureasa en la harina de soya y contrastar su acción en la tiourea. 

Palabras claves:Actividad enzimática, Soya, Determinación, Temperatura, pH, Espectrofotometría UV.

Abstract:

The enzymatic activity of urease, the main enzyme of Soybean Meal, was determined through UV spectrophotometry; Reaction rate dependence analysis was performed as a function of the enzymatic amount (composition), temperature and pH. Likewise, the specificity of the enzymatic action was analyzed, using the presence of urease in the soybean meal and contrasting its action in the thiourea.

Key words: Enzymatic activity, Soya, Determination, Temperature, pH, UV spectrophotometry.

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Introducción

Las enzimas son moléculas de naturaleza proteínica producidas por los seres vivos, desempeñan un papel esencial en el metabolismo de todos los organismos, se encargan de acelerar reacciones químicas o hacer posibles aquellas reacciones que de otra manera no se producirían. En pocas palabras, son catalizadores biológicos que, al reducir la energía de activación necesaria para las reacciones, transforman las sustancias involucradas en el metabolismo celular (incluyendo el anabolismo o reacciones de construcción, y el catabolismo o reacciones de destrucción). La velocidad de la reacción catalizada por una enzima depende del pH, de la fuerza iónica, de la temperatura y de la presencia o ausencia de inhibidores (Burns, 1982; Lorens, 2010).

La liberación de enzimas es un proceso constante y, aunque las plantas y animales intervienen, son los microorganismos los que contribuyen en mayor medida a este proceso, debido a su gran biomasa, su alta actividad metabólica y su corto ciclo de vida (Cerón y Melgarejo, 2005). .

La ureasa es una exoenzima que cataliza la reacción de hidrólisis de la urea, el principal producto celular nitrogenado de la degradación de las proteínas y los ácidos nucleicos, el cual es más fácil de eliminar que otras formas de nitrógeno (como el amoniaco) porque es soluble en agua y menos tóxico (Science in School, 2008). En dicha reacción, la urea se rompe para formar dióxido de carbono y amonio, como se describe en la siguiente reacción (Quintero-Lizaola et al., 2005):

CO(NH2)2  + H2O ⇑ 2NH3 + CO2

La ureasa también es considerada una Amido hidrolasa que actúa sobre los enlaces no peptídicos de amidas lineales tales como la Urea y sus derivados (Bremner&Mulvaney,  1982)

La ureasa se encuentra principalmente en semillas, microorganismos e invertebrados. En las plantas, es un hexámero (consiste en seis cadenas idénticas) y se encuentra en el citoplasma. En las bacterias, consiste en dos o tres subunidades diferentes. Para su activación necesita unir dos iones de níquel por subunidad (Science in School, 2008). Su pH óptimo es 7.4, y su temperatura óptima 60 °C (Kandeler y Gerber, 1988).

Las técnicas para obtener una  determinación cuantitativa de ureasa en muestras se basan en que la tasa inicial de la reacción catalítica es proporcional al número de moles presentes, el cual se podría calcular a partir del número de moles de sustrato que reaccionan por minuto y mol de enzima bajo condiciones estándares. (Casanova & Benavides, 1995). En nuestro caso usaremos la determinación por espectrofotometría UV.

Materiales y metodología

Se prepararon diferentes disoluciones que se dejaron en reposo durante 8 días, las disoluciones preparadas fueron:

• Solución de Ureasa: se Pesó 14 g de harina de soya, y se depositaron en un vaso de precipitado, se adicionó 100 mL de glicerol al 75%, y se  agitó la suspensión por 15 minutos, se  taparla y se  llevó al refrigerador por un día. Luego se filtró el extracto glicerinado a través de una gasa.
• Solución de Ureasa. Se  disolvió 0.1 g de Ureasa a 100 mL con solución de glicerol al 75% conservándola en refrigerador.
• Solución Buffer de Fosfato de Sodio 1mM pH 7.00.
• Solución Urea 1% p/v en Buffer de fosfato de sodio 1mM pH 7.00.
• Solución Tiourea 1% p/v en Buffer de fosfato de sodio 1mM pH 7.00
• Solución Rojo fenol 0.1% p/v en solución de etanol-agua.
• Solución de NaOH 2 M.
• Solución de Ácido Fosfórico 2M.

Determinación de la actividad enzimática del extracto de Ureasa

∙ Con una pipeta de vidrio de 5 mL se midieron 3 mL de la solución de urea 1 % p/v, y se introducen en una cubeta de espectrofotómetro. Se adicionaron 100 μL de solución buffer fosfato y 100 μL de solución de rojo fenol,  se tapó la cubeta con un pedazo de Parafilm y se agitó.

∙ Se limpiaron cuidadosamente con un paño las caras lisas de la cubeta.

∙ Se introduce la cubeta en el compartimiento de muestra del espectrofotómetro, procurando que el haz de luz del mismo atraviese la cubeta por las caras lisas.

∙ Se ajustó el espectrofotómetro a cero de absorbancia o 100 % de transmitancia con el mando correspondiente.

∙ Se  configuró el espectrofotómetro en modo de lectura continuo para que registre medidas de absorbancias cada 15 seg durante 1 minuto.

∙ En otra celda se puso con una pipeta 3 mL de la solución de urea 1 % p/v, 100 μL de solución de rojo y lo más rápidamente posible se realizaron las siguientes operaciones: *se  midió 100 μL de la solución de la enzima y se introdujo en la cubeta de sustrato (Momento de inicio de la reacción). * Se tapó la cubeta con un trozo de Parafilm, y se invierte 2 o 3 veces para mezclar bien el contenido de la cubeta.

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