Caracterización morfológica, molecular, bioquímica y funcional de cepas de “Rhizhobium” asociadas a leguminosas forrajeras de las provincias Pichincha y Cotopaxi

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR[pic 1][pic 2]

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

PROYECTOS DE TITULACIÓN PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO AGRÓNOMO

TÍTULO:      

Caracterización morfológica, molecular, bioquímica y funcional de cepas de “Rhizhobium” asociadas a leguminosas forrajeras de las provincias Pichincha y Cotopaxi.

LÍNEA:                     31, Ciencias Agrarias

SUBLÍNEA:             3102-Ingeniería Agronómica

AUTOR:                 Daniela Mishell Chuquimarca Mamarandi  [pic 3]

TUTOR:                  Venancio Saúl Arahana Bonilla [pic 4]

LECTOR 1:               [pic 5]

LECTOR 2:              [pic 6]

DURACIÓN:           6 meses

PRESENTADO:      Tumbaco/ Quito 22 de noviembre de 2022

DEDICATORIA:

Esta tesis está dedicada a:

A Dios quien ha sido mi guía, fortaleza y su mano de fidelidad y amor han estado conmigo hasta el día de hoy.

A mis padres quienes con su amor, paciencia y esfuerzo me han permitido llegar a cumplir hoy un sueño más, gracias por inculcar en mí el ejemplo de esfuerzo y valentía, de no temer las adversidades porque Dios está conmigo siempre.

A mis hermanos por su cariño y apoyo incondicional, durante todo este proceso, por estar conmigo en todo momento gracias.

 A toda mi familia porque con sus oraciones, consejos y palabras de aliento hicieron de mí una mejor persona y de una u otra forma me acompañan en todos mis sueños y metas.

Finalmente quiero dedicar esta tesis a todas mis amigas, por apoyarme cuando más las necesito, por extender su mano en momentos difíciles y por el amor brindado cada día, de verdad mil gracias hermanitas, siempre las llevo en mi corazón.

AGRADECIMIENTOS:

Quiero expresar mi gratitud a Dios, quien con su bendición llena siempre mi vida y a toda mi familia por estar siempre presentes.

Mi profundo agradecimiento a todas las autoridades y personal que hacen Universidad Central del Ecuador Facultad de Ciencias Agrícolas Carrera de Ingeniería Agronómica, por confiar en mí, abrirme las puertas y permitirme realizar todo el proceso investigativo dentro de su establecimiento educativo.

Finalmente quiero expresar mi más grande y sincero agradecimiento al Señor Venancio Saúl Arahana Bonilla, principal colaborador durante todo este proceso, quien con su dirección, conocimiento, enseñanza y colaboración permitió el desarrollo de este trabajo.

RESUMEN:

Firmas bacterianas asociadas a nódulos de raíces de leguminosas en la provincia de Cotopaxi, Ecuador, para promover identificación y tipificación bacteriana de la rizosfera y sus tipos de plantas leguminosas en zonas con problemas de salinización, sistemas agrícolas con poca información sobre técnicas y microbios del suelo. A través de técnicas morfológicas, bioquímica y Microscopía Electrónica de Barrido (SEM), identificación y caracterización de 10 cepas de bacilos Gram-negativos, ciclo del nitrógeno, fijación, simbiosis leguminosa, importancia de las leguminosas, bacterias fijadoras, taxonomía, rhizobium, infección, bases moleculares, flavonoides y factores, crecimiento rápido y coloración característica de los productores de limo, rizobios y tolerancia a soluciones salinas y alcalinas y otras cosas que investigue para mi tesis. El análisis molecular del gen 16S reveló un predominio del género Pseudomonas, que se conoce como la bacteria.

Palabras claves. Nódulos, rizosfera, Gram-negativos, simbiosis, flavonoides, gen 16s, pseudomonas.

ABSTRACT:

Bacterial signatures associated with legume root nodules in the Cotopaxi province, Ecuador, to promote identification and bacterial typing of the rhizosphere and its types of legume plants in areas with salinization problems, agricultural systems with little information on techniques and soil microbes . Through morphological, biochemical and Scanning Electron Microscopy (SEM) techniques, identification and characterization of 10 strains of Gram-negative bacilli, nitrogen cycle, fixation, legume symbiosis, importance of legumes, fixing bacteria, taxonomy, rhizobia, infection , molecular bases, flavonoids and factors, rapid growth and characteristic coloration of slime producers, rhizobia and tolerance to saline and alkaline solutions and other things that I investigated for my thesis. Molecular analysis of the 16S gene revealed a predominance of the genus Pseudomonas, which is known as the bacterium.

ÍNDICE

                                                                                                                Pág.

         Portada ………………………………………………………………… 1

         Dedicatoria …………………………………………………………… 2

        Agradecimiento ………………………………………………………… 3

        Resumen ………………………………………………………………… 4

        Abstract ………………………………………………………………… 5

1. Introducción ………………………………………………………………… 10

1. Planteamiento del problema …………………………………………… 11

1. Justificación…………………………………………………………………. 12 al 13      
2. Objetivos. …………………………………………………………………… 13  

1. Objetivo general.  ………………………………………………………  13
2. Objetivo específico. ……………………………………………………   13 al 14

1. Hipótesis. …………………………………………………………………… 14
2. Marco teórico. ……………………………………………………………… 15

1. Ciclo del nitrógeno. …………………………………………………… 15
2. Fijación de nitrógeno. ………………………………………………… 15 al 16
3. Simbiosis Leguminosa – Rhizobium………………………………….. 16 al 17
4. Especies de leguminosas forrajeras ………………………………….. 17

1. Alfalfa …………………………………..……………………… 17 al 18
2. Trébol …………………………………..……………………… 18 al 19

1. Importancia de las leguminosas forrajeras …………………………. 19 al 20
2. Bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico ……………………….. 20

1. Taxonomía …………………………………………………….. 20 al 21
2. Rhizobium …………………………………………………….. 21 al 22
3. Infección de la planta ………………………………………… 22
4. Bases Moleculares de la Interacción Rhizobium-Leguminosa 22 al 23
5. Flavonoides y Factores de Nodulación ………………………. 23
6. Lectinas ………………………………………………………… 23 al 24  
7. Polisacáridos Bacterianos que Intervienen en la Simbiosis … 24
8. Genes que Participan en la Simbiosis ……………………….. 24 al 25
9. Tipos de Nódulos ……………………………………………… 25 al 26
10. Fisiología de los Nódulos ……………………………………. 26 al 27

1. Materiales y Métodos. …………………………………………………… 27

1.  Ubicación ……………………………………………………………. 27
2. Materiales ……………………………………………………………. 27

1. Materiales de laboratorio …………………………………… 27 al 28
2. Equipos ……………………………………………………….. 28
3. Reactivos ……………………………………………………… 28 al 29
4. Materiales de análisis y trabajo …………………………….. 29

1. Métodos ………………………………………………………………. 29

1. Colección de nódulos ………………………………………… 29 al 30
2. Fase de laboratorio- Aislamiento y caracterización de la bacteria. 30

1. Aislamiento de “Rhizobium” ……………………… 30 al 31
2. Purificación de cepas ………………………………. 31
3. Conservación de las cepas …………………………. 31
4. Caracterización de las cepas ………………………. 31

1. Variables culturales ……………………………… 31al 32

1. Caracterización Molecular ………………………… 32

1. Extracción de ADN de los aislamientos de Rhizobium 32
2. Amplificación PCR de secciones  ……………. 32 al 33
3. Amplificación y secuenciación de fragmentos …… 33 al 34
4. Análisis bioinformático …………………………….. 34

1. Fase Invernadero - Caracterizar funcionalmente cepas …. Pg. 34

1. Desinfección y germinación in vitro de las semillas de las leguminosas forrajeras ………………………………… 35
2. Implementación del ensayo de invernadero …… 35 al 36

1. Factores de estudio …………………………………………………. 36

                     5.4.1. Tratamientos …………………………………… 36

1. Unidad experimental …………………………….. 36
2. Diseño experimental ……………………………… 37
3. Número de repeticiones …………………………..  37
4. Esquema del análisis de varianza ……………….. 37
5. Análisis funcional ………………………………… 37
6. Variables para evaluar …………………………… 38

1. Costos y cronograma …………………………………………………… 39

1. Costos …………………………………………………………….. 39 al 40
2. Cronograma ………………………………………………………  41 al 42

1.  Referencias bibliográficas ^[a]……………………………………………… 43 al 46
2. LISTADO DE CUADROS.

Cuadro No 1. Materiales de laboratorio ……………… 27 al 28

Cuadro No 2. Equipos ……………… 28

Cuadro No 3. Reactivos ……………… 28 al 29

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