Determinacion cuantitativa riboflavina

OBJETIVOS

1) El alumno conocerá el manejo de un fluorómetro de filtros.

2) Construirá una curva de calibración de la riboflavina para determinar la concentración de ésta en una muestra problema.

3) Conocerá el efecto del pH del disolvente sobre la intensidad de fluorescencia.

INTRODUCCION

La espectrometría de fluorescencia es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una técnica complementaria es la espectrometría de absorción. Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros o fluorímetros.

En la teoría de la fluorescencia se habla de que las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía. La espectrometría de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrónicos. En general, las especies objeto de examen tendrán un estado electrónico basal (un estado de baja energía) de interés, y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados vibracionales. En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los distintos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado. La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues, mediante el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometría de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles de vibración.
Se le llama espectro de emisión cuando se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente emitida por una muestra, manteniendo la luz de excitación a una longitud de onda constante. Mientras que en un espectro de excitación se mide mediante el registro de una serie de espectros de emisión utilizando luz de diferentes longitudes de onda.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORMES

1) Elaboración de la curva de calibración

[pic 1]

La emisión fluorescente observada en una determinada especie está condicionada por la estructura molecular de la sustancia y por otros factores dependientes del medio en que se trabaje. Esto quiere decir que para que exista fluorescencia, la molécula debe poseer una estructura capaz de absorber radiación ultravioleta o visible; la rigidez es un factor estructural importante, ya que experimentalmente se observa que la fluorescencia está particularmente favorecida en moléculas que poseen este tipo de estructuras rígidas ya que tienden a limitar las vibraciones.

La influencia del disolvente también es un factor importante ya que en muchas ocasiones se observa que al aumentar la polaridad del disolvente se produce un desplazamiento en el espectro de fluorescencia hacia mayores longitudes de onda. En la mayoría de las moléculas polares el estado excitado es más polar que el estado fundamental; por ello, al aumentar la polaridad del disolvente se tiende hacia una estabilización del estado excitado, en mayor grado que lo hace el estado fundamental. En consecuencia, al aumentar la polaridad del disolvente tiene lugar un desplazamiento hacia mayores longitudes de onda (menor energía).

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