Determinación Cuantitativa De La Hemoglobina Glicosilada (Hb1Ac)

Conservar a 2 - 8ºC.

PRINCIPIO DEL MÉTODO

La HbA1c es un ensayo turbidimétrico para la cuantificación de hemoglobina glicosilada en sangre total humana. La concentración de HbA1c se expresa como el porcentaje de concentración de hemoglobina HbA1c sobre la hemoglobina total (THb) de la muestra.

La molécula de hemoglobina liberada como consecuencia de lisis de los hematies, es hidrolizada por acción de una proteasa, y los derivados de hemoglobina resultantes se convierten en hematina alcalina, que presenta una absorción a 600 nm.

La HbA1c se mide utilizando un método de inhibición de la aglutinación de partículas de látex. Las partículas de látex recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-HbA1c compiten con la HbA1c de la muestra cuando se mezclan con un reactivo constituido por partículas de polímero sensibilizadas con haptenos de HbA1c. La presencia de HbA1c en la muestra inhibe la aglutinación de las partículas de látex. El grado de aglutinación de las partículas es indirectamente proporcional a la concentración de HbA1c de la muestra y puede cuantificarse por comparación con un calibrador de concentración de conocida.

SIGNIFICADO CLÍNICO 1-3

La Diabetes Mellitus es una enfermedad crónica caracterizada por la presencia de hiperglicemia en la sangre del paciente. Las consecuencias más inmediatas son los trastornos metabólicos de carbohidratos, lípidos y proteínas. El riesgo asociado a las complicaciones de esta enfermedad, entre las cuales se incluyen la nefropatía, retinopatía y enfermedades cardiovasculares, aumenta en pacientes con escaso control metabólico. En los pacientes diabéticos, donde los niveles de glucosa en sangre son elevados, la HbA1c se forma como consecuencia de una glicosilación no enzimática del grupo N-terminal de la cadena β de la molécula de hemoglobina. El nivel de HbA1c es proporcional al nivel de glucosa en sangre y es ampliamente aceptado como un indicador de la media de concentración diaria de glucosa durante un periodo de tiempo de 6-8 semanas. Además, se le considera un indicador de control diabético a largo plazo, mientras que la concentración de glucosa es solo un indicador de corto plazo (Nota 1) .

REACTIVOS

Reactivo Hemolizante (R3)

Pepsina porcina en solución tampón. Conservantes. pH, 2,4.

Reactivo Hb Total (R4)

Sodio hidróxido 0.4%, Triton 2,5%. pH, 13.

HbA1c – Látex (R1)

Partículas de látex sensibilizadas con anticuerpo monoclonal anti-HbA1c (ratón), BSA, detergente 0,6% y Proclin 150 0,1%, en tampón. pH, 8,1.

Reactivo Aglutinante (R2)

Haptenos de HbA1c covalentementa unidos a un polímero, BSA, detergente 0,2% y Proclin 150 0,1%. pH, 2,0.

Opcional

Ref: 43095 HbAc CAL. Calibradores (6) de HbAc.

11Ref: 43096 HbA1c CONTROL. Controles (2) de HbA1c.

PRECAUCIONES

El Reactivo de Hb Total, contiene sodio hidróxido, que es cáustico, y causa quemaduras. Utilizar guantes. En caso de accidente, lavar el área afectada con abundante agua y solicitar la ayuda de un médico.

CALIBRACION7-9

La sensibilidad del ensayo así como los valores de los calibradores han sido estandarizados con un Material de Referencia Interno, trazable a un método de HPLC para la HbA1c y al método de Drabkin’s para la Hb Total.

No es recomendable el uso de otros calibradores de HbA1c comerciales.

Ensayo de Hb Total: Spinreact recomienda usar el Calibrador de HbA1c (Ref: 43095) para la calibración.

Ensayo de HbA1C: Spinreact recomienda usar el Calibrador de HbA1c (Ref: 43095) para la calibración.

Los Calibradores no necesitan pretratamiento.

PREPARACIÓN

Reactivos: Listos para el uso.

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD

Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el envase cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, y se evita la contaminación durante su uso. No utilizar reactivos que hayan sobrepasado la fecha de caducidad.

Indicadores de deterioro de los reactivos: Presencia de partículas y turbidez. Proteger los reactivos de temperaturas extremas, luz y congelación.

MATERIAL ADICIONAL

- Baño de agua a 37ºC.

- Espectrofotómetro o fotómetro con cubeta termostatizable a 37ºC para lecturas a 600 (580 – 620) nm.

MUESTRAS

Se puede usar sangre venosa o capilar.

Se recomienda utilizar EDTA potásico o Heparina amónica como anticoagulantes. Estable 7 días a 2-8ºC ó 3 meses a –20ºC.

Las muestras congeladas deberán descongelarse a temperatura ambiente, y homogenizarse ligeramente antes de usar.

TRATAMIENTO DE LA MUESTRA

1. Preparar en un tubo una dilución 1/41 de la muestra en Reactivo Hemolizante:

10 μL sangre total + 400 μL Reactivo Hemolizante (R3)

2. Tapar el tubo y agitar suavemente evitando la formación de espuma.

3. Incubar un mínimo de 5 minutos a temperatura ambiente.

Estabilidad: La muestra tratada es estable 2 horas a temperatura ambiente o 8 horas a 2-8ºC.

PROCEDIMIENTO

ENSAYO DE Hb TOTAL:

1. Calentar el Reactivo de Hb Total y el fotómetro (portacubetas) a 37ºC.

2. Condiciones del ensayo:

Longitud de onda: 600 nm (580 – 620)

Temperatura: 37ºC

Paso de luz de la cubeta: 1 cm

3. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.

4. Pipetear en una cubeta:

Reactivo Hb Total (R4) (mL)

1.0

Calibrador (0 y 1)Nota 2 o muestra (μL)

80

5. Mezclar y leer la absorbancia frente al blanco a los 5 minutos (A2) de efectuada la mezcla.

ENSAYO DE HbA1c:

1. Calentar el Reactivo de HbA1c - Látex (R1), el Reactivo Aglutinante (R2)

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