Determinacion Cuantitativa De Bilirrubina

PRINCIPIO DEL MÉTODO

La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido sulfanílico diazotado midiéndose fotométricamente. De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubin-glucurónido y bilirrubina libre ligada a la albúmina, sólo la primera reacciona en medio acuoso (bilirrubina directa) precisando la segunda la solubilización con cafeína para que reaccione (bilirrubina indirecta). En la determinación de la bilirrubina indirecta se determina también la directa, correspondiendo el resultado a la bilirrubina total. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de bilirrubina presente en la muestra ensayada.

SIGNIFICADO CLÍNICO

La bilirrubina se origina por la degradación de la hemoglobina.

Es transportada del bazo al hígado y se excreta en la bilis.

La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas más probables de la hiperbilirrubinemia:

Bilirrubina Total: Aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas.

Bilirrubina Directa: Colestasis hepática, alteraciones genéticas y alteraciones hepáticas.

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

REACTIVOS

R 1 (D) ACIDO SULFANILICO 30 mmol/L

ACIDO CLORHIDRICO 150 mmol/L

R 2 (T) ACIDO SULFANILICO 30 mmol/L

ACIDO CLORHIDRICO 50 mmol/L

DIMETILSULFOXIDO 7mol/L

R 3 SODIO NITRICO 29 mmol/L

opcional BILURRUBIN CAL

CALIBRADOR DE BILIRRUBINA 20 mg/dl Ref:1002250

PREPARACIÓN

Todos los reactivos están listos para su uso.

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD

Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial, cuando se mantienen los viales bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita la contaminación durante su uso.

No usar reactivos fuera de la fecha indicada.

Indicadores de deterioro de los reactivos:

- Presencia de partículas y turbidez.

- Desarrollo de color en el R 2.

MATERIAL ADICIONAL

- Espectrofotómetro o analizador con cubeta para lecturas a 540 nm.

- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.

- Equipamiento habitual de laboratorio.

MUESTRAS

Suero o plasma libre de hemólisis1. Proteger de la luz.

Estabilidad de la muestra: 4 días a 2-8ºC o 2 meses a –20ºC.

PROCEDIMIENTO

1. Condiciones del ensayo:

Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 540 nm

Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz

Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15-25ºC

2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.

3. Pipetear en una cubeta:

blanco B. Total Blanco B. Directa

R 1 (D) -- -- 1.5 1.5

R 2 (T) 1.5 1.5 -- --

R 3 -- 50 -- 50

MUESTRA 100 100 100 100

4. Mezclar e incubar exactamente 5 minutos a 15-25ºC.

5. Leer la absorbancia (A).

CALCULOS

-Con calibrador

(A) Muestra – (A) blanco muestra x conc. Calibrador = mg/dl de bilirrubina

(A) calibrador – (A) blanco calibrador

-con factor

(A) muestra – (A) blanco muestra x factor = mg/

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