ENSAYO COLORIMETRICO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE 6-O-Α-L-RAMNOSIL-D-GLUCOSIDASA DE ACTINOPLANES MISSOURIENSIS

Reporte de práctica: Análisis de Alimentos[pic 1]

ENSAYO COLORIMETRICO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE   6-O-Α-L-RAMNOSIL-D-GLUCOSIDASA DE ACTINOPLANES MISSOURIENSIS

COLORIMETRIC ESSAY OF THE ENZYMATIC ACTIVITY OF 6-O-Α-L-RAMNOSIL-D-GLUCOSIDASE OF ACTINOPLANES MISSOURIENSIS

 Prado-Guzmán, G. A.1,^[1]*

1Instituto Tecnológico de Tepic. Av. Tecnológico #2595, Col. Lagos del Country. C.P. 63195. Tepic, Nayarit, México.

Fecha de envío: 18 de abril del 2018.

Resumen:[pic 2]

Se determinó la actividad enzimática de -O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, una enzima de vital importancia en la industria alimentaria y de la salud, ya que juega un papel primordial en la hidrólisis de  enlaces glicosidicos, siendo este uno de los mecanismos más empleados en la industria de alimentos en el procesamiento de jugos y demás bebidas, y en el área de la salud generándose metabolitos secundarios como los flavonoides que poseen propiedades antioxidantes con efectos positivos en el organismo, entre otras. La determinación se llevó a cabo mediante un ensayo colorimétrico, el cual nos permitió determinar las condiciones óptimas a partir de las variaciones de pH y temperatura. El ensayo se llevó a cabo en el laboratorio virtual Biomodel y posteriormente los datos de absorbancias obtenidas fueron sometidos al programa Statistica con la herramienta superficie de respuesta para encontrar los valores óptimos matemáticamente y comparara con los obtenidos experimentalmente y de bibliografía.

Palabras clave: -O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa,  actividad enzimática, colorimetría, flavonoides, hidrólisis.

Abstract:

The enzyme activity of -O-α-L-ramnosyl-D-glucosidase, an enzyme of vital importance in the food and health industry, was determined, since it plays a key role in the hydrolysis of glycosidic bonds, being one of the most used mechanisms in the food industry in the processing of juices and other beverages, and in the area of ​​health generating secondary metabolites such as flavonoids that have antioxidant properties with positive effects in the body, among others. The determination was carried out by means of a colorimetric assay, which allowed us to determine the optimum conditions from the variations of pH and temperature. The trial was carried out in the Biomodel virtual laboratory and subsequently the absorbancies data obtained were submitted to the Statistica program with the response surface tool to find the optimal values ​​mathematically and compared with those obtained experimentally and from bibliography.

Keywords: -O-α-L-ramnosyl-D-glucosidase, enzymatic activity, colorimetry, flavonoids, hydrolysis.[pic 3]

1. Introducción

En la actualidad, las glicosil-hidrolasas son un grupo de enzimas que se han vuelto popularmente empleadas en procesos  de hidrólisis de enlaces glicosídicos, los cuales forman parte de los enlaces de azúcares reductores. Una vez que se lleva a cabo la hidrólisis de éstos enlaces en las plantas, se da lugar a la generación de metabolitos secundarios denominados flavonoides. Estos compuestos, han captado la atención de diversos campos de investigación debido a que poseen la cualidad de actuar como agentes antioxidantes en las plantas, protegiéndolas de diversos daños ocasionados por rayos ultravioleta, patógenos, algunos agentes contaminantes como metales, y en general de daños causados por agentes oxidantes. En el área de la salud algunos de éstos compuestos han presentado una participación activa como preventivos de enfermedades, antiinflamatorios, etc. Por otra parte en el área de alimentos poseen una fuerte demanda en el procesamiento de derivados de cítricos y uvas, específicamente en jugos ayudando a su clarificación y eliminación de sabores amargos.

En alusión a lo anterior y sabiendo de las propiedades catalíticas que poseen las enzimas, hoy en día se buscan métodos para determinar las condiciones óptimas que generen una mayor actividad enzimática de éstas mismas, para poder así emplearlas en diversos procesos tecnológicos de interés. Uno de los métodos más empleados es la determinación de actividad enzimática empleando métodos colorimétricos, los cuáles nos permiten determinar las condiciones óptimas de pH y temperatura (factores que limitan o determinan la actividad enzimática) a las cuáles una enzima trabaja con mayor eficiencia a partir de sus variaciones.  Esto se determina en base a la velocidad de reacción o en su defecto lo que podemos leer como la variación de la absorbancia a un determinado tiempo de haber iniciado la reacción.

2. Marco teórico

2.1 Glicosil-hidrolasas

Las glicosil-hidrolasas constituyen un grupo amplio y variado de enzimas cuya característica común es la capacidad de hidrolizar el enlace glicosídico que forma el eslabón de enlace de los azúcares (Izzo et al., 2014).

Dentro de las glicosil-hidrolasas encontramos las diglicosidasas (glicosidasas disacárido específicas) capaces de liberar residuos disacarídicos que se encuentran en la naturaleza unido a diversas moléculas, e.j: flavonoides, terpenos, isoprenoides, etc. Algunos flavonoides comunes incluyen naringina, narirutina, rutina, diosmina y hesperidina. Hesperidina se encuentra en frutas cítricas, como limón, naranjas y pomelos, y su hidrólisis mediante glicosidasas se emplea industrialmente para clarificación de jugos de fruta y remoción del sabor amargo (Manzanares et al. 2001)

Rutina es un compuesto abundante en alimentos como trigo sarraceno, los cítricos, el té negro, cáscaras de manzana, cebollas, uvas y avena (HERRMANN, 1976), su desglicosilación enzimática se utiliza en la industria para la obtención de quercetina. La quercetina tiene una mayor actividad antioxidante que su diglicósido rutina, exhibiendo propiedades antialergénicas, antiproliferativa y antibacteriana (Gaberščik et al., 2002) (Fig. 2).

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Fig.2. Estructura química de los flavonoides (a) hesperidina (hesperetina 7-O-(6-O-α-Lramnopiranosil-β-D-glucopiranósido) y (b) rutina (quercetina 3-O-(6-O-α-L-ramnopiranosil-β- D-glucopiranósido).

2.2 Ensayo de actividad enzimática de la ramnosil glucosidasa

El ensayo emplea una reacción con el DNS (dinitrosalicilato). El DNS, de color amarillo en medio básico, se reduce a 3-amino-5-nitrosalicilato, de color rojo ladrillo: 

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(El aldehído del azúcar reductor se oxida a ácido) Se mide el color rojo del producto a 540 nm. Los azúcares reductores se forman cuando la enzima, 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa (EC 3.2.1.168), hidroliza el enlace glucosídico de un sustrato que añadimos, la hesperidina.

La hesperidina es un glicósido natural, formado por la unión de rutinosa con hesperetina. La rutinosa es el disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosa (Herráez, n.d.).

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2.3 Desglicosilación de flavonoides

El mecanismo de desglicosilación de flavonoides habitualmente involucra dos enzimas que actúan de forma secuencial (Sarry & Günata, 2004), primero una monosacaridasa cliva el enlace glicosídico, luego una β-D-glucosidasa libera la aglicona (Günata et al., 1998). Las endoglicosidasas tienen la habilidad de clivar (cortar) un enlace glicosídico en el medio de una cadena de azúcares (modo “endo”) y por lo tanto la desglicosilación en un solo paso de los flavonoides diglicosilados requiere la ruptura de la unión aglicona – diglicosido, lo que resulta en la liberación de la aglicona y el disacárido correspondiente, es decir un mecanismo endo de acción (Ogawa et al., 1997). Las diglicosidasas hidrolizan el mismo enlace que las beta-glucosidasas, y en la actualidad se han descripto solo cuatro actividades que reconocen los disacáridos, la primeverosa, acuminosa, rutinosa y vicianosa  (Mazzaferro & Breccia, 2011). Algunas glicosil-hidrolasas actúan mediante el mecanismo de retención, el cual conserva la configuración anomérica del compuesto y le confiere la capacidad de transglicosilación, aplicable en síntesis y modificación de fármacos.

2.4 Aplicación de desglicosilación de flavonoides en el área de alimentos.

Los glucósidos de flavona son metabolitos secundarios abundantes de plantas que están involucradas en muchos aspectos de la fabricación de productos derivados de cítricos y uvas. Algunas características, como el sabor amargo o la turbidez del jugo, se atribuyen en cierta medida a estos compuestos (Manthey & Grohmann, 1996). La desglucosilación de diferentes glucósidos de flavonas representa un desafío en la tecnología de los alimentos para el débito y la clarificación de los jugos de frutas (Hemingway et al., 1999; Wang et al., 2001). Los procesos de desglicosilación también encuentran aplicación en las bebidas de origen vegetal, como el vino o té, para aumentar el sabor del producto final mediante la liberación de terpenos volátiles (MA et al., 2001).

2.5 Factores que afectan la actividad enzimática

La velocidad a la que las reacciones enzimáticas proceden depende de varios factores, dentro de los que destacan el pH del medio de reacción, la temperatura, la concentración de sustrato y de enzima y el agua disponible en el medio (Badui, 2006).

2.5.1 Efecto del pH

La actividad de las enzimas depende de la concentración de iones hidronio del medio, ya que esto afecta el grado de ionización de los aminoácidos de la proteína, incluidos los del sitio activo, del sustrato (en caso de ser ionizable), o del complejo enzima-sustrato; de hecho, el pH influye en la estructura tridimensional de la proteína y, a su vez, sobre la afinidad que tenga la enzima por el sustrato (Badui, 2006).

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