Extracción de ADN Rotura Celular

Rotura Celular.

Es uno de los pasos más importantes en la purificación del DNA. Los métodos más utilizados para la rotura de células como, sonicación, alta presión, no se pueden utilizar en la purificación del DNA. Estos procedimientos aplican fuerzas poderosas para lisar las células y pueden romper el DNA en fragmentos pequeños. El mejor procedimiento para la rotura de las células y la obtención de DNA intacto es mediante la aplicación de agentes químicos (detergentes) y/o procedimientos enzimáticos. Los detergentes pueden solubilizar los lípidos en las membranas de las células. Además, los detergentes poseen un efecto inhibidor sobre la DNAsa y pueden desnaturalizar proteínas, ayudando de este modo a la extracción de las mismas de la solución. La lisis de las células animales suele realizarse usando detergentes aniónicos como el sulfato de sodio (SDS).

Extracción de las Proteínas.

El segundo paso en la purificación consiste en la extracción de contaminantes importantes, es decir, proteínas, del lisado celular. Este procedimiento se denomina desproteinización. La extracción de las proteínas de la solución del DNA se basa en las diferencias de las propiedades físicas entre los ácidos nucleicos y las proteínas. Estas diferencias son diferencias de solubilidad, las diferencias en el volumen específico parcial y diferencias de sensibilidad ante enzimas digestivas.

Desproteinización utilizando disolventes orgánicos.

Los métodos más utilizados para la extracción de proteínas se basan en las diferencias de solubilidad entre proteínas y ácidos nucleicos frente a solventes orgánicos. En los ácidos nucleicos predominan las moléculas hidrofilicas y por lo tanto son fácilmente solubles en agua. Las proteínas, por otro lado, contienen muchos residuos hidrófobos haciéndolos parcialmente soluble en disolventes orgánicos. Existen varios métodos de desproteinización basándose en esta diferencia y varían según la elección del disolvente orgánico.

Los disolventes orgánicos comúnmente utilizados son el fenol y el cloroformo que contengan 1% de alcohol isoamílico. El método que utiliza el agente deproteinizador como fenol fue introducido por Kirby (1957) y que se suele hacer referencia como método de Kirby. El uso de la mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico fue introducido por Marmur (1961) y se llama al método Marmur. Estos métodos han sufrido numerosas modificaciones y mejoras desde el momento de su primera publicación.

La aplicación de fenol en el método de Kirby se basa en el siguiente principio. El fenol es cristalino a temperatura ambiente, pero en presencia de 20 por ciento de agua que forma una suspensión acuosa que contiene micelas de fenol rodeada de moléculas de agua. Las moléculas de proteínas contienen generalmente muchos residuos hidrofóbicos, que se concentran en el centro de la molécula. Cuando una solución de proteína acuosa se mezcla con un volumen igual de fenol, algunas moléculas de fenol se disuelven en la fase acuosa (aproximadamente 20 por ciento de agua y 80 por ciento de fenol). Sin embargo, las moléculas de fenol son extremadamente hidrofóbico. En consecuencia, tienden a ser más solubles en el hidrófobo núcleos de la proteína que en agua. Como resultado, las moléculas de fenol difunda en el núcleo de la proteína haciendo que la proteína se hinche y, finalmente, a desplegar o desnaturalizar. La proteína desnaturalizada, con su hidrófobo grupos expuestos y rodeado de micelas de fenol, es mucho más soluble en la fase de fenol que en la fase acuosa. Como resultado se particionan proteínas en la fase de fenol dejando los ácidos nucleicos en la fase acuosa.

Los ácidos nucleicos no tienen grupos hidrófobos en absoluto y son insolubles en el fase fenol. Aplicación del método de fenol requiere mezclar la fase fenol con la fase acuosa. Esto introduce algún cizallamiento de moléculas de ADN.

Dado que sólo cantidades relativamente pequeñas de proteína pueden disolver en un volumen dado de fenol, se requiere la extracción repetida de la fase acuosa con fenol a fin de eliminar toda la proteína. Debido a que la fase de fenol a la saturación Contiene 20 por ciento de agua cada extracción con fenol eliminará el 20 por ciento del ADN en la fase de fenol. Incluso más ADN se pierde por atrapamiento en la capa de interfase de proteínas precipitadas o cuando el pH de las gotas de fenol por debajo de pH 8,0.

Otro inconveniente del método de Kirby es que los productos de oxidación de fenol pueden reaccionar químicamente con el ADN (y ARN) moléculas. En adición, fenol es altamente tóxico y requiere procedimientos especiales de eliminación.

Con el fin de minimizar estos efectos, varias modificaciones han sido introducidas.

1. El uso de detergentes iónicos. Estos detergentes, desplegando la proteína, ayudar a exponer las regiones hidrófobas de las cadenas polipeptídicas a fenol micelas, ayudando de este modo de partición de las proteínas en la fase de fenol.

2. eliminación enzimática de las proteínas antes de la extracción con fenol. Esto reduce la número de extracciones necesarias, lo que limita la pérdida y el cizallamiento del ADN.

3. La adición de 8HQ (8-hidroxiquinolina) al fenol. Esto aumenta la solubilidad de fenol en agua. En presencia de este compuesto de fenol permanece licuado a temperatura ambiente con sólo el 5 por ciento de agua. En adición,

4. 8HQ se oxida fácilmente y, por lo tanto, desempeña el papel de un antioxidante, protector de fenol frente a la oxidación. Dado que la forma reducida de 8HQ es de color amarillo y la forma oxidada es incolora, la presencia o ausencia de amarillo color es un excelente indicador visual del estado de oxidación del fenol.

5. Ajustar el pH de la solución de fenol saturado con agua a pH por encima de 8, por
equilibración del fenol licuado con un tampón fuerte o borato de sodio.
El DNA obtenido por el método de Kirby es generalmente de peso molecular alto, pero
contiene impurezas de aproximadamente 0,5 por ciento de proteína que se pueden quitar
por otro método.
La aplicación de una mezcla de cloroformo: alcohol isoamílico (CIA) mezcla en el
método desproteinización de Marmur, se basa en una característica de este
disolvente orgánico que difiere de fenol. El cloroformo no es miscible
con agua y, por lo tanto, incluso numerosas extracciones no dan lugar a
la pérdida de DNA en la fase orgánica. La acción de desproteinización de cloroformo esta
basado en la capacidad de las cadenas de polipéptido desnaturalizado para entrar parcialmente o estar inmovilizado en la interfase-cloroformo agua. Ya que
la acción de desproteinización de cloroformo se produce en la interfase cloroformo-agua, la   eficiente desproteinizacion depende de la formación de una gran área de la interfase. Para lograr esto, se tiene que formar una emulsión de agua y cloroformo. Dado que el cloroformo no se mezcla con agua, esto sólo puede hacerse por agitación vigorosa. Un emulsionante, alcohol isoamílico, se añade a cloroformo para ayudar a formar la emulsión y para aumentar el área de superficie-cloroformo agua.
El método de Marmur es muy eficiente en la recuperación de ADN, pero requiere
repetidas extracciones que consumen mucho tiempo cuando grandes cantidades de proteínas
están presentes. Además, las extracciones de cloroformo requieren bastantes mezclas vigorosas que contribuyen al rompimiento hidrodinámico de grandes moléculas de DNA.
El uso de este método permite obtener ADN muy puro, pero de tamaño limitado
(20.000-50.000 pares de bases). El método es útil para la preparación de DNA a partir de virus con genomas pequeños o cuando el DNA de bajo peso molecular es suficiente para los experimentos (por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa o PCR).
Una mejora sustancial en el método se puede lograr limitando el número de extracciones.

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