INFORME DE LABORATORIO DE SEPARACION DE FRAGMENTOS DE ADN PROCESADOS CON ENZIMAS DE RESTRICCION MEDIANTE ELECTROFORESIS

INFORME DE LABORATORIO DE SEPARACION DE FRAGMENTOS DE ADN PROCESADOS CON ENZIMAS DE RESTRICCION MEDIANTE ELECTROFORESIS                                                                      CRISTIAN ALVARADO MANTILLA 19181018                                                                                        UNIVERSIDAD DE SANTANDER-MEDICINA

Introducción

La electroforesis, es un proceso en el cual se lleva a cabo la separación de moléculas, dependiendo de la movilidad que cada una de ellas tenga, dentro de un campo eléctrico.

Dicha separación puede hacerse en una superficie que se encuentre hidratada con una base sólida, en una matriz de tipo poroso, o también en disolución. Según el tipo de técnica mencionada a utilizar, la separación de las moléculas seguirá en distinta proporción a la carga eléctrica que tengan las moléculas, además de a la masa de cada una de ellas.

El soporte más utilizado para analizar las mezclas entre proteínas u otras sustancias, como por ejemplo, ácidos nucleicos, es el gel; el cual suele estar constituido por agar, u otras sustancias, como la poliacrilamida.

En el caso de los ácidos nucleicos, los cuales poseen una carga eléctrica negativa, se dirigirán al lado ( polo) positivo, en cambio, las proteínas, consiguen cargarse cuando se unen con otras sustancias como por ejemplo, un detergente, el cual les proporciona cargas negativas según la masa molecular que tenga cada proteína. Cuando añadimos la mezcla de las moléculas, y le aplicamos un campo eléctrico, estas se desplazarán, moviéndose y atravesando la malla que conforma el gel. De esta manera, las moléculas de menor tamaño, se desplazan más, y las moléculas con un tamaño mayor, se desplazarán mínimamente (1)

Puede ser manual, la cual usa soportes no restrictivos, estos se emplean cuando las moléculas son de gran tamaño y tiene dificultad para desplazarse, además emplea menos tiempo , este un procedimiento es realizado por un servidor, o puede ser capilar, la cual es totalmente automatizada y emplea soportes restrictivos los cuales tienen resultados de mayor resolución.

Objetivo

-Visualizar a partir de una electroforesis manual los fragmentos del ADN, obtenidos en el laboratorio anterior de digestión mediante enigmas de restricción, con esto podemos observar los tamaños de los diferentes fragmentos.

Palabras clave

-soporte

-voltaje

-buffer

Metodología

1. Para preparar agarosa al 0.8% para una cámara horizontal 10 x 0.5 x 0,5 cm, disolver 0.8 g de Agarosa en100 mL de buffer TBE 1X., mezclar la agarosa con el buffer bajo calentamiento y agitación hasta que ebulla(Se puede usar microondas) y marque previamente el aforo para controlar la evaporación, si el nivel bajacomplete con agua destilada. Cuando vaya a disolver la agarosa en el microondas asegúrese de utilizar un Erlenmeyer que contenga de 2-4 veces el volumen de la solución. Verificar que la agarosa se ha disuelto totalmente en caso de no ser así colóquela más tiempo en el microondas (la solución debe ser transparente y no deben observarse particulas suspendidas). Tan pronto vierta la agarosa en la bandeja, asegurese de la inexistencia de burbujas, en caso tal retírelas can una punta de micrapipeta.

2. Retirar los peines cuidadosamente para que los pozos queden bien formados

3. Previo a colocar las muestras en el gel, verifique que los pozos tienen la ubicación correcta; es decir que las muestras van a migrar hacia el polo positivo (rojo).

4. Al servir las muestras debe evitarse que se salgan del pozo.

5. Asegúrese de utilizar un marcador de peso molecular apropiado, es decir que los tamaños de los fragmentos de éste sean útiles para estimar los de su muestra de ADN (que la muestra se encuentre dentro del El rango del marcador de peso molecular).

6. Organice la bandeja para servir el gel con los separadores o con cinta según sea el caso figura 3 y 4, esta debe estar totalmente limpia y nivelada utilizando para ello el indicador de nivel.

7. Cuando la temperatura del gel baje a 50°C-60°C aproximadamente agregue bromuro de etidio a una concentración de 0.5ug/mL (3ul) y mezcle para permitir que el bromuro se disperse homogéneamente. En este paso deberá utilizar doble guante.

8. Vierta la agarosa en la bandeja evitando la formación de burbujas e inmediatamente coloque el peine.

9. Deje solidificar el gel a temperatura ambiente durante 30 minutos y retire el peine.

10. Preparación de la Cámara de electroforesis; agreque la cantidad justa de buffer TBE 1X a la cámara de

electroforesis, lleve el gel a la cámara y asegúrese que el buffer TBE 1X cubra el gel sin sobrepasar el 1imite máximo establecido por la cámara. Excesiva cantidad de bufer de electroforesis podría decrecer la movilidad del ADN y promover la distorsión de bandas. Además de causar un excesivo calentamiento del sistema.

11. Preparación de las muestras a analizar

12. Coloque 3 uL de buffer de carga sobre papel parafilm y luego adicione la muestra de ADN, mezcle con una micro pipeta y sírvala dentro de los pozos del gel, evitando perforar los pozos. A os pozos se les asigna un código o número.

13. En uno de los pozos coloque una mezcla de 5 pL de marcador de peso molecular para determinar el tamaño de su ADN aislado.

14. Coloque la tapa de la cámara y conecte los polos eléctricos de manera que el ADN migre hacia el cátodo.

15. Si los polos se unen correctamente se generan burbujas debido a la electrolisis y dentro de poco tiempo los colorantes migran sobre el cuerpo del gel.

16. La fuente de poder se coloca a 90 Voltios. Voltaje y amperaje constantes. Tiempo estimado 30 min.

17. Transcurrido el tiempo y después de observar la migración correcta de los colorantes se lleva al transiluminador (debe ubicarse en un cuarto oscuro y no debe mirarse directamente sin usar gafas con protector de rayos ultravioleta). Observar las bandas y analizar el barrido de las muestras.

18. La fotografía del gel depende de la tinción utilizada, en el caso del bromuro de etidio con transiluminador se utiliza una apertura focal de 5.6 y la rapidez con que se abre el diafragma es de medio segundo.

Resultados

[pic 1]

Imagen 1. Fragmentos de ADN obtenidos de la electroforesis manual marcados con bromuro de etidio, el cual le adquiere una coloración naranja.

-Se puede apreciar que las bandas de ADN muestran un aspecto uniforme, en cuanto a tamaño y forma

Desempeño del estudiante

Interpreta los resultados de diferentes geles de acuerdo a la técnica usada (Se encuentra en la introducción.)

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