INFORME, LABORATORIO 3: ACTIVIDAD ENZIMATICA E INMOVILIZACIÓN DE LA INVERTASA.

INFORME, LABORATORIO 3: ACTIVIDAD ENZIMATICA E INMOVILIZACIÓN DE LA INVERTASA

1. Introducción

En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances y, paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtención de productos  químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica.

Con el presente informe de laboratorio se pretende mostrar y analizar los resultados obtenidos en la práctica de laboratorio correspondiente a la actividad de  inmovilización enzimática, utilizando un métodos de inmovilización por atrapamiento, lo cual permitió la comparación de  la actividad de la enzima sobre su sustrato cuando se encuentra en estado libre e inmovilizada y a su vez se realizaran los correspondientes análisis relacionados con la actividad de la enzima y las diferencias de la misma, presentando las gráficas y cálculos realizados durante su análisis bajo los cuales estarán basadas las conclusiones y análisis de resultados presentados en el informe.

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente (1). Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte (2).

Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar (3):

1. El aumento de la estabilidad de la enzima;
2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.
3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada.

Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son (4):

1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.
2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la movilización.
4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.

• Método de inmovilización por Atrapamiento

Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros fotoentrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero.

Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las micro cavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos.

Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína.

• INVERTASA

Es una enzima que convierte la sacarosa en glucosa y fructosa. Está presente en el intestino delgado, en el borde del cepillo de las vellosidades intestinales. La ausencia de sacarosa provoca una enfermedad denominada intolerancia a la sacarosa, de difícil diagnóstico, muchas veces se confunde con la intolerancia a la lactosa.

Pertenece a la familia de las disacaridasas, que son las enzimas que se encargan de romper los disacáridos en los monosacáridos que los forman.

• Metodología.

Actividad enzimática:

Enzima libre

1. Se prepararon 50 ml de solución de sacarosa al 20%  y se llevó a un baño termostato a una temperatura de 40ºC.

1. Se preparó la solución de la enzima libre con 0.1 mg de la enzima Invertasa con 5 ml de agua destilada.

1. Se tomaron 6 tubos de ensayo  y se marcaron de la siguiente forma:

Y a su vez en cada tubo de ensayo se agregaron 500 micro litros de DNS excepto en la muestra 0 o blanco.

1. Se adicionaron 0.5 ml de la solución de la enzima libre a la solución de sacarosa y se tomó una alícuota de 0.5 ml para depositarla en un tubo de ensayo marcado como 1 ya que esta alícuota se tomó como el tiempo cero.

1. El procedimiento se repite a medida que pasa el tiempo se toma la alícuota de 0.5 ml de la solución de sustrato-enzima libre y se depositaba en el  correspondiente tubo de ensayo.

1. Una vez realizadas todas las tomas de la muestra, se llevaron los 7 tubos de ensayo a ebullición por 5 minutos, y se preparó un tubo blanco que contenía 500 micro litros de agua destilada y de DNS

1. Una vez transcurrido el tiempo de ebullición se agregó en cada tubo 10 ml de agua destilada y se dejaron reposar por 10 minutos.

1. Finalmente se realizó la lectura de la Absorbancia a los 7 tubos de ensayo con una longitud de onda de 510 nm.

• INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

1. Se prepararon 50 ml de solución de alginato de sodio al 3% y se le adiciono 0.1 mg de la enzima la cual era la Invertasa.

1. Se prepararon 1.5 ml de solución de cloruro de calcio al 3% p/v

1. Se tomó la solución de alginato y se introdujo en una jeringa, una vez realizado esto, se hizo gotear la solución de alginato de sodio (polímero de algas) y enzima en la solución de cloruro de calcio, de la cual se obtuvo alginato de calcio y esferas en cuyo interior se encuentra la enzima.

[pic 1][pic 2][pic 3]

1. Se filtraron las esferas y se lavaron con agua destilada, para ser pesadas.

[pic 4]

1. Se tomaron 5 g de la enzima inmovilizada contando la cantidad de esferas y se agregaron a la solución de sacarosa.

1. Se tomó una alícuota de 0.5 ml y se depositó en un tubo de ensayo previamente marcado como tiempo 0.

1. Se llevó a un baño termostatado a 40ºC y se tomaron mediciones en los mismos tiempos planteados para la actividad de la enzima libre tomando siempre 0.5 ml de la solución en cada tiempo y agregándolo en el tubo de ensayo correspondiente los cuales contenían previamente  500 micro litros de DNS.

1. Una vez realizadas todas las tomas de la muestra, se llevaron los 7 tubos de ensayo a ebullición por 5 minutos

1. Transcurrido el tiempo de ebullición se agregó en cada tubo 10 ml de agua destilada y se dejaron reposar por 10 minutos.

1. Finalmente se realizó la lectura de la Absorbancia a los 7 tubos de ensayo con una longitud de onda de 510 nm.

1. Resultados obtenidos

Resultados obtenidos para la actividad enzimática de la enzima libre

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