INFORME DE LABORATORIO Enzimología II: Inhibición de la actividad enzimática

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INFORME DE LABORATORIO

Enzimología II: Inhibición de la actividad enzimática

Bioquímica General

Nombre de autores: Jilberto Marcela

Müller Jorge

Schultze Anahí

Nombre de docente y ayudante: Ramírez Sebastián

Silva Debbie

Fecha: Miercoles 18 de Abril del 2016

Discusión

La enzima fosfatasa ácida de germen de trigo, es una enzima hidrolasa que cataliza el rompimiento de enlaces fosfoéster, liberando fosfato inorgánico, cataliza la hidrolisis de anhídridos y monoéster de fosfato a un pH óptimo entre 4 y 7, esta hidroliza su sustrato artificial (pNPP) generando como producto (pNP) en condiciones alcalinas, puede ser cuantificado con absorbancia a 405nm. Los factores que modifican la actividad enzimática, entre los más importantes son; la concentración de la enzima, la concentración del sustrato, la temperatura, el pH y los inhibidores (competitivo, a competitivo y mixto). Muchos tipos de moléculas inhiben las enzimas, y actúan de diversas formas, pueden provocar una inhibición reversible o irreversible, en las reversibles encontramos 3 inhibidores muy importantes, inhibidor competitivo, estos compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima, y aumentamos la cantidad de sustrato, el efecto inhibidor se revierte alcanzándose la velocidad máxima, esta también el inhibidor no competitivo, se enlazan a un sitio distinto del activo, de manera que el inhibidor se puede unir a la enzima libre o bien al complejo enzima sustrato, pero en ninguno de los casos obtendremos productos, el efecto de estos inhibidores no se revierte por el agregado de mayor cantidad de sustrato, de manera que se llega a una velocidad máxima menor que si no tuviera el inhibidor, finalmente existe el inhibidor mixto, que puede realizarse de las dos maneras [2]. La molécula p-Nitrofenol tiene la capacidad de absorber luz a 405nm, es por eso, que posee un color amarillo.

En el primer tubo no se agregó la enzima fosfatasa, por lo tanto, la muestra luego del baño termorregulador no cambio de color, su color blanco (incoloro), cuando se determina una velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima a distintas concentraciones de esta, en presencia de concentraciones saturantes de sustrato y manteniendo constante los otros factores ambientales, como la temperatura y el pH, se puede establecer la relación entre cantidad de enzima y actividad, y como en el tubo uno no se agregó la enzima fosfatasa, no se pudo realizar ninguna comparación, ya que, se encontraba solamente en presencia de sustrato (pNPP), ni observar la actividad enzimática, tampoco se logró establecer qué tipo de inhibidor estaba presente puesto que no se añadió la fosfatasa ácida de germen de trigo, además se realizó el procedimiento para medir la absorbancia de la solución y esta arrojo 0. En el caso contrario,  en el segundo tubo si se utilizó la enzima fosfatasa arrojando (luego de todos los procedimientos) un color amarillo claro con absorbancia de 0,154, a medida que aumenta la cantidad se sustrato (actuando como sustrato pNPP), la velocidad aumenta en forma lineal (zona proporcional) , luego la velocidad sigue aumentando pero ya no lo hace lineal (zona mixta) hasta que finalmente la reacción alcanza una velocidad máxima que es constante, se vuelve independiente de la cantidad de sustrato (zona saturación). Esto ocurre debido a que los sitios de activación de la enzima, se encuentran todos interactuando con las moléculas de sustrato, por lo tanto, hasta que no finalice la reacción la enzima no puede unirse a otro sustrato. Además la enzima está trabajando en su estado básico, por la inactividad enzimática, finalmente esta solución es amarilla debido a la presencia de la molécula p-Nitrofenol (molécula desprotonada). El tercer tubo arrojo un color celeste y de absorbancia 0,80 cuando mayor cantidad de enzima este presente, mayor será la velocidad que se alcanzara, debido a que necesita más cantidad de sustrato para alcanzar la saturación, la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración de sustrato. Por ejemplo, si la concentración  de enzima es disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reacción es reducida también a la mitad original [4]. En el cuarto tubo en comparación con el quito tubo, de absorbancia el cuarto arrojo 0,070 y el quinto 0,015, esto se debe a la cantidad de sustrato que fue inducida en la solución,  aparte de la concentración de sustrato, en estos tubos y en los anteriores, la temperatura es clave en todas las soluciones, un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reacción hasta cierta temperatura, la temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de la actividad catalítica debida a la desnaturacion térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse. A pH extremos las proteínas se desnaturalizan, por lo tanto, la actividad biológica decae. Algunas enzimas no varían su actividad con el pH sino que esta se mantiene constante en un amplio rango. Otra tendrá el pH óptimo ácido teniendo en cuenta el medio donde actúa. Hidroliza el sustrato artificial p-Nitrofenil fosfato generando como producto p-Nitrofenol (en condiciones alcalinas). [3]

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