Laboratorio de bioquímica Actividad enzimática: Tirosinasa

Laboratorio de bioquímica        

Actividad enzimática: Tirosinasa        

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Resumen

En esta práctica se determinó la actividad enzimática de la tirosinasa y la influencia de factores como la temperatura, la concentración y el pH. Dicho procedimiento se llevó a cabo mediante la utilización de un extracto de papa como fuente de la enzima y el sustrato l-metildopa, el producto formado se siguió por medio del espectrofotómetro. El espectrofotómetro se calibró a 420 nm, configurándose primeramente con el blanco y luego se adiciono a cada celda la mezcla del preparado procediendo a obtener las lecturas de las absorbancias cada 20 segundos por tres minutos. A partir de los datos obtenidos se realizó una curva de calibración con la que se pudo analizar el comportamiento de la actividad enzimática en el tiempo bajo los distintos factores. Con el análisis de los resultados se concluye que las condiciones de la enzima son específicas para la catálisis de la reacción que lleva a cabo.

Palabras clave: Tirosinasa, temperatura, concentración, pH, enzima, sustrato, actividad enzimática

Introducción

Las polifenoloxidasas son las responsables de las reacciones de pardeamiento enzimático que ocurren durante el almacenamiento, manipulación y procesamiento de frutas y vegetales. Las polifenoloxidasas, también conocidas como tirosinasas, fenoloxidasasas, monofenoloxidasas o cresolasas, catalizan la hidroxilación de monofenoles a ortodifenoles, posteriormente oxidados a ortoquinonas, las cuales se polimerizan dando lugar a pigmentos que se presentan de color marrón, rojo o negro, dependiendo de los componentes naturales presentes en los tejidos vegetales. (1) La tirosina hidroxilasa está implicada en la catálisis del primer paso de conversión de la l-tirosina en l-dopa, este último siendo precursor de la síntesis de las catecolaminas. (2)

En esta práctica se utilizará la enzima tirosinasa obtenida del extracto de la papa y se hará reaccionar con el l- metildopa, el cual se convierte en el metildopacromo, este último compuesto es una sustancia coloreada que se podrá seguir su aparición en la reacción por medio del espectrofotómetro a una longitud de onda de 420nm.

La actividad de la enzima será medida bajo distintos factores que influyen en su desarrollo catalítico como lo son: La concentración de la enzima, temperatura y pH.  Por medio de los valores de absorbancia se podrá calcular la actividad enzimática bajo cada uno de los factores condicionantes a través de una gráfica de absorbancia vs tiempo.

Métodos

La práctica se basó en determinar la actividad de la enzima bajo diferentes condiciones por medio de la técnica de espectrofotometría. Primeramente, se evaluó la actividad de la enzima bajo condiciones estándar de temperatura y pH. El extracto enzimático fue aislado de la solución obtenida posterior a la maceración de 10 g papa en un mortero pre enfriado, fue agregado una solución de 10 ml de buffer fosfato, la cual se usa para mantener un ambiente de pH óptimo para la proteína. Posteriormente se centrifugó para lograr la separación de los componentes líquidos y sólidos de la mezcla y se decantó la solución sobrenadante para obtener el componente líquido. Esta solución se llevó a un volumen final de 1/10 y se nombró como extracto enzimático. La solución permaneció durante toda la práctica en la nevera, para evitar el pardeamiento.        

Para la medida de la actividad enzimática en condiciones estándar se usó 1 ml de extracto enzimático, 3 ml de buffer pH 7,2 y 1 ml de l-metildopa. El blanco para la calibración del espectrofotómetro fue preparado con 1 ml de extracto enzimático y 4 ml de del buffer 7,2. Se calibra el espectrofotómetro con el blanco a una longitud de onda de 420 nm; e inmediatamente después se agrega el sustrato l-metildopa a la solución, luego se leen los valores de absorbancia. La primera lectura se toma como tiempo 0, posterior a esto se van tomando las absorbancias cada 20 segundos durante 3 minutos, para un total de 10 lecturas.        

Después de medir la actividad enzimática en condiciones estándar, se mide la actividad catalítica bajo distintas concentraciones de enzima. La primera lectura se hace con 1,5 ml de extracto de enzima, 1 ml de l-metildopa y 2,5 ml de buffer pH 7,2; el blanco es preparado con 1,5 ml de extracto y 3,5 ml de buffer pH 7,2. La segunda lectura se realiza con 2 ml de extracto enzimático, 1 ml de l-metildopa y 2 ml de buffer pH 7,2, el blanco para este caso es preparado con 2 ml de extracto enzimático y 3 ml de buffer pH 7,2. Y para la tercera lectura se usa una cantidad de 2,5 ml de extracto enzimático, 1 ml de l-metildopa y 1,5 ml de solución buffer pH 7,2, su blanco es preparado con 2,5 ml de extracto enzimático y 2,5 ml de solución buffer pH 7,2. Estas tres concentraciones se leen en el espectrofotómetro después de tarar con el blanco correspondiente a cada concentración y agregar el sustrato l-metildopa. Las absorbancias se toman cada 20 segundos durante 3 minutos.        

Para la medida de la actividad enzimática bajo diferentes pH, se toman los datos obtenidos en la medida de actividad enzimática bajo condiciones estándar el pH de 7,2. Los demás pH para realizar las lecturas de absorbancias son 6,0 y 10,2. se usan las mismas medidas de extracto enzimático, buffer (a pH Indicado) y solución de l-metildopa usadas para la lectura de absorbancias de la actividad enzimática bajo condiciones estándar. Estas dos soluciones se leen en el espectrofotómetro después de tarar con el blanco y agregar el sustrato l-metildopa. Las absorbancias se toman cada 20 segundos durante 3 minutos.

En la medida de la actividad enzimática bajo diferentes temperaturas se usan las mismas medidas de extracto enzimático, buffer pH 7,2 y solución de l-metildopa usadas para la lectura de absorbancias de la actividad enzimática bajo condiciones estándar. Las absorbancias para la temperatura de 25°c se toman de la medida de actividad enzimática en condiciones estándar. Se preparan dos tubos de ensayo con las mezclas y uno de ellos es sumergido en un baño maría a 37°c y el segundo tubo se lleva a un baño de hielo a 2°c. estas dos soluciones se leen en el espectrofotómetro después de tarar con el blanco y agregar el sustrato l-metildopa. Las absorbancias se toman cada 20 segundos durante 3 minutos.        

Luego de realizar las soluciones y obtener sus correspondientes valores de absorbancia, los datos son graficados en una curva de calibración para cada una de las influencias medidas sobre la enzima: Concentración, pH y temperatura. De esta forma se podrá medir el comportamiento de la actividad enzimática a través del tiempo.

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