INFORME DE PURIFICACION DE PROTEINAS 19 Y 42

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Resumen

La purificación de proteínas implica aislarlas a partir de su fuente en base a diferencias en sus propiedades físicas. El objetivo de un esquema de purificación es retener la mayor cantidad de proteína funcional con el menor número de contaminantes. El esquema de purificación de una proteína debe ser optimizado para  completar  el  proceso  en  el  menor  número  de  pasos posible. Se utilizó un modelo simulador de purificación de proteínas, en  el  cuál  se  aplicaron  distintos  métodos  de separación para intentar purificar la proteína N°19 y N° 42.

Palabras     claves:     Purificación,     Filtración     por     gel, Cromatografía de Intercambio iónico, pH, Proteína.

Introducción

Hoy en día, el papel de las biomoléculas poliméricas —el ácido desoxirribonucleico ADN), el ácido

ribonucléico (ARN) y las proteínas— en las aplicaciones biotecnológicas se estudia en todos los niveles educativos. El uso de nuevas tecnologías como la proteómica permite analizar, identificar y caracterizar péptidos y proteínas provenientes de diversas matrices biológicas y no biológicas, de forma eficiente y reproducible. Esto puede facilitar el desarrollo de nuevos biomarcadores. El uso de marcadores proteicos reduce sustancialmente la contaminación de las muestras en comparación con el ADN. Las técnicas de separación y purificación de proteínas son de gran  importancia  en  los  avances  del  área  de  las  ciencias biológicas y de la biotecnología, pues de esta manera se puede conocer la función que éstas poseen en las células (ya sea estructurales, enzimáticas,  de transporte, entre otras).  Las técnicas de purificación se basan en las propiedades físicas y químicas de estas moléculas, e implican  

la separación de una proteína  de  una  mezcla  de  moléculas  con  características similares donde la proteína de interés constituye una mínima fracción.

Por  esto,  es  necesario  aprovechar  las  características  que diferencian a unas proteínas de otras, como pueden ser su tamaño y forma, masa molar, carga neta, punto isoeléctrico, hidrofobicidad,  su  interacción  con  iones  metálicos, solubilidad, termo resistencia, entre otras. Las técnicas que sirven  para  separar  y  purificar  proteínas  pueden  ser  de precipitación,  adsorción,  electroforéticas,  y  cromatografías. Para las técnicas de precipitación existen agentes precipitantes que pueden ser cationes y aniones; las técnicas cromatografías se efectúan con filtración en gel, columnas de intercambio  iónico, columnas de  interacción hidrofóbica o covalentes, entre otras; para la electroforesis se encuentra de una dimensión (basada en el tamaño molecular de la proteína) o de dos dimensiones (basada en tamaño molecular y punto isoeléctrico de la proteína en cuestión).  El fraccionamiento de sulfato de amonio consiste en salar las proteínas, la concentración de sal a la que la proteína precipita cambia para cada proteína individual. Esta propiedad se usa aquí para hacer la fracción de diferentes proteínas en la mezcla. El tratamiento térmico simplemente se puede afirmar como purificación por desnaturalización. En la filtración en gel, el tamaño decide la depuración. Aquí la muestra se aplica a una columna de perlas porosas. dependiendo del tamaño entran o retienen las cuentas. De acuerdo con el conocimiento preexistente de tamaño y su entrada en perlas, se realiza la purificación.

En la Cromatografía de intercambio iónico, las perlas se separan en función de su carga. Si la proteína tiene una carga positiva general, entonces se une a una columna de perlas, de lo contrario no.

La Cromatografía de interacción hidrofóbica indica que la separación depende de la fuerza de vanderwaals entre proteínas y ligandos en la mezcla. Como las diferentes proteínas tienen una asociatividad diferente hacia los ligandos, hace que produzcan y purifiquen. La Cromatografía de afinidad explica que la separación se basa en la afinidad relativamente alta de las proteínas con grupos químicos específicos.[pic 2]

Actualmente se cuenta con un gran número de técnicas de separación y purificación de proteínas, pero el problema reside en conocer qué técnica utilizar en base a las propiedades de la proteína deseada.  

Metodología

La parte experimental de esta práctica se llevó a cabo mediante  el  uso  del  software  Protein  Purification desarrollado por la  Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Leeds; el cual se encuentra disponible  vía online en  la dirección http://www.agbooth.com/pp_ajax/.

1. Purificación de la proteína N°19

Comienzo: Seleccionamos comienzo desde el principio, nos dirigimos a la opción ensayar una mezcla y elegimos complex mixture y le damos en purificar a la enzima 19.[pic 3]

Figura 1. Complex mixture

Separación: Seleccionamos el método Filtración en gel, nos dirigimos a medios de filtración en gel, escogemos la opción Ultrogel ACA 54.

Figura 2. Medios de Filtración en gel

Fracciones: Escogemos la opción ensayar la actividad enzimática y seleccionamos combinar fracciones y tabulamos un rango que se encuentre dentro de la actividad enzimática y le damos en verificar y aparece el comportamiento de la actividad enzimática.

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Figura 3. Combinar fracción[pic 5]

Figura 4. Ensayo de la calidad Enzimática

Page:  Seleccionamos la opción Page en  2  dimensiones  y aparecerá un diagrama con las proteínas separadas. Luego escogemos la opción Page Wester Blot donde observamos la representación  de  cómo  debería  quedar  purificada  nuestra enzima 19.[pic 6]

Figura 5. Proteínas purificadas[pic 7]

Figura 6. Representación de la proteína 19 a purificar

Después  de  utilizar  diferentes  métodos  de  separación  nos damos cuenta que con el método filtración en gel tenemos como resultado de la purificación menor cantidad de proteínas en  solución  y  continuamos  con  los  siguientes  métodos sucesivamente.

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