Informe de laboratorio: cuantificación y propiedades de proteínas
Enviado por Alejo Ardila • 28 de Julio de 2023 • Informe • 1.321 Palabras (6 Páginas) • 35 Visitas
Universidad de Ciencias Ambientales y Aplicadas
[pic 1]INFORME DE LABORATORIO: CUANTIFICACIÓN Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS
- Angie Yamile Garcia Hernandez
- Rafael Esteban Peña Herrera
- Jhon Alejandro
Palabras Clave Proteína cuantificación punto isoeléctrico enlace peptídico Analito | R ESU M EN En la práctica de laboratorio realizada se estudia una técnica para la cuantificación de proteínas y se estudian algunas propiedades de estas biomoléculas como su solubilidad y el punto isoeléctrico de la caseína, para lo anterior es necesario realizar un extracto rico en proteínas. Para el extracto se pesan 10 g de harina de haba y se añaden 30 ml de NaCl al 1%, luego se agita durante una hora con ayuda de un agitador magnético, al finalizar el tiempo se centrifuga la mezcla para separar las fases líquida y sólida, en este caso se trabaja con el sobrenadante ya que allí se encuentran las proteínas extraídas de la harina de haba. Al extracto obtenido se le realiza un tratamiento adicional para separar las proteínas globulinas y las albúminas, el tratamiento consiste en mezclar 5 ml del extracto crudo obtenido inicialmente con sulfato de amonio sólido hasta un 50 % posteriormente se deja en frío durante 15 minutos y se centrifuga nuevamente, en esta ocacion en el precipitado estarán presentes las globulinas y en el sobrenadante obtendremos las albúminas. La cuantificación de proteínas se realiza mediante un método espectrofotométrico en donde reaccionan las proteínas con el reactivo de biuret formando un complejo coloreado al cual podemos medir su absorbancia a 540 nm, se hace la preparación y lectura de un blanco de reactivos y una curva de calibración previa a las lecturas de las muestras. En la determinación del punto isoeléctrico de la caseína se preparan una serie de soluciones con diferente pH y se añade 1 ml de leche a cada uno, después de transcurrir una hora se observa lo sucedido y se mide el pH de cada tubo |
- RESULTADOS
- OBTENCION DE PROTEINAS A PARTIR DE HARINA DE HABA Y AVENA CON PRECIPITACION A PARTIR DE SULFATO DE AMONIO.
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Figura 1. Extracto de avena
En la figura 1 se puede observar el extracto preparado a partir de la adición de una solución NaCl 1% para aumentar la solubilidad hidrofílica según el principio de salting out o precipitación salina. algunos solutos como proteínas o polímeros precipitan debido al aumento de las interacciones hidrofóbicas entre ellos. Este fenómeno está vinculado al fenómeno cosmotrópico ejercido por algunas sales. La concentracción salina y el tipo de sal requerida para la precipitación varían de soluto a soluto. Este fenómeno es empleado para la separación de proteínas. Al aplicar una centrifugación de 400 rpm a 4°C se desnaturalizan lo cual genera un cambio de la estructura y permita la separación lipídica de toda su composición. También ajustar el PH favorece la solubilidad de estas mismas.
b) CUANTIFICACION DE LAS PROTEINAS POR EL METODO DE REACTIVO DE BIURET POR ESPECTOFOTOMETRIA VIS A 540 nm
Las proteínas en solución son incoloras. Entonces, para determinar su presencia y/o concentración mediante espectrofotometría visible se las debe someter a algún tipo de reacción que desarrolle color en su presencia. Esto es, que forme un producto coloreado que absorba en el espectro visible. Si la intensidad del color desarrollado luego de la reacción colorimétrica es proporcional a la cantidad de proteínas presentes en la muestra, dicha reacción podrá utilizarse para cuantificar la concentración de proteínas.
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Tabla 1. Preparación de disoluciones de avena a 37°C
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Figura 2. Curva de calibración con reactivo de biuret.
Como se puede apreciar en la tabla 1 es la preparación de cada una de las disoluciones que están marcadas desde T1 a T9 donde desde T1 a T7 son las concentraciones de nuestra muestra, T8 es el precipitado de extracto y T9 es el sobrenadante del extracto. Todas estas disoluciones se llevaron a un espectrofotómetro y se midió su absorbancia.
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Grafica 1. curva de calibración con disoluciones de albumina en mg/ml.
Se tiene la concentración de albumina correspondiente a cada punto de la curva según su absorbancia aplicando la ley de Lambert beer, sin embargo, en la gráfica 1 se observa que la curva no es del todo lineal ya que tiene un coeficiente de correlación de 0.961, por lo que podría darse exponencialmente, sin embargo existe tendencia lineal por lo que se cuantifica con la curva corregida previamente con el blanco de reactivos que equivale a son 0.002 como se observo en el tubo 1 y 7 en la tabla 1. Los extractos fueron cuantificados bajo esta curva con reactivo biuret en la misma cantidad que la curva y con la misma dilución del blanco, con 0,5 ml de agua y 4 ml de reactivo de biuret como se ve a continuación en la figura 4.
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