Los métodos experimentales para conocer la actividad catalítica

● INTRODUCCIÓN

Las enzimas son moléculas especializadas en la catálisis de las reacciones químicas que tienen lugar en la célula. Son muy eficientes como catalizadores ya que son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones químicas y son altamente específicas. Las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones combinándose transitoriamente con los reactivos de manera que estos alcanzan un estado de transición con una energía de activación menor que el de la reacción no catalizada.

Los métodos experimentales para conocer la actividad catalítica

de las enzimas son cada vez más sofisticados, sin embargo, el método más antiguo fue desarrollado por Leonor Michaelis Y Maud Menten, el cual consiste en analizar cómo varía la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente en función de algunos parámetros experimentales como lo es la Vmáx y la Km. La velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato y Km que corresponde a la una medida de afinidad de la enzima por el sustrato, cuantitativamente es el valor de la concentración de sustrato en la que la velocidad máxima tiene el siguiente valor 1⁄2 Vmax. Valores bajos de una Km indican una alta afinidad, mientras que valores muy altos de Km indican una baja afinidad por el sustrato.

Existen una serie de sustancias llamadas inhibidores, que inhiben o anulan la acción de las enzimas sin ser transformados por ellas. La inhibición enzimática puede ser irreversible o reversible, esta última comprende a su vez tres tipos: inhibición competitiva, no competitiva e incompetitiva.

Algunos inhibidores se combinan de manera permanente con la enzima uniéndose covalentemente al grupo esencial funcional para la catálisis, de esta forma la enzima queda inactivada de manera irreversible. Los inhibidores reversibles se combinan de manera transitoria con la enzima, algunos se combinan con la enzima libre y otros con el complejo sustrato, en este grupo se pueden observar tres tipos de inhibición:

✓ Inhibición competitiva: el inhibidor es una molécula que presenta cierto parecido estructural con el sustrato, de manera que puede competir con él por acceder al centro activo, el inhibidor forma con la enzima libre un complejo enzima ­inhibidor.

enzima libre ni afecta su unión con el sustrato, sino que lo hace con el complejo enzima­sustrato dando lugar a un complejo inactivo enzima­sustrato­inhibidor. El inhibidor se coloca próximo al centro activo de tal manera que impide la salida de los productos finales.

✓ Inhibición no competitiva: el inhibidor puede combinarse con la enzima libre o con el complejo enzima­sustrato, interfiriendo en la acción de ambos, estos se unen en un lugar diferente al centro activo.

El inhibidoroxamato de sodio es un ​inhibidor competitivo ​de la lactato deshidrogenasa debido a que este compuesto tiene una estructura molecular similar a la del sustrato de la enzima, el Piruvato, con lo cual puede ocupar el sitio activo de esta y desplazar al sustrato.Por lo que el valor de Vmax no se altera, mientras que la Km disminuye.

● OBJETIVOS

­Determinar la Vmax y Km de la LDH por medio de diferentes modelos gráficos.

✓ Inhibición incompetitiva: el inhibidor no se combina con la

­Analizar los efectos del oxamato sobre la cinética de la LDH. ­Identificar qué tipo de inhibición ejerce el oxamato sobre la LDH.

● RESULTADOS

Gráfica 1. Curva temporal. Actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato (NADH) durante 90 segundos. NOTA: Los tiempos fueron medidos de 3s en 3s.

Gráfica 2. Curva temporal. Actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato (Piruvato) durante 90 segundos, en presencia de un inhibidor (Oxamato de Sodio). NOTA: Los tiempos fueron medidos de 3s en 3s.

Gráfica 3. Michaelis­Menten para la enzima LDH a diferentes concentraciones de sustrato (Piruvato). NOTA: Para graficar se utilizaron los datos hasta los 33 segundos, dado que las actividad de las concentraciones 0.25, 0.36 y 0.5 de piruvato sin el inhibidor, descendían rápidamente pesea estar diluidas 1:50.

Gráfica 4. Linealización de Lineweaver­Bur​k. ​Dobles recíprocos para la enzima LDH a diferentes concentraciones de sustrato (Piruvato). NOTA: Para graficar se utilizaron los datos hasta los 33 segundos, dado que las actividad de las concentraciones 0.25, 0.36 y 0.5 de piruvato sin el inhibidor, descendían rápidamente pese a estar diluidas 1:50.

Tabla 1. Velocidades máximas y Constante de Michaelis­Menten para la enzima LDH a partir de los datos de la Gráfica. 4.

Sin inhibidor Con inhibidor

m 532.590

4

m 1045.0625

b 649.358

6

b 842.3662

V max (μmol mL^­1 min ^­1)

0.0015 V max

(μmol mL^­1 min ^­1)

0.0012

Km (mM) 0.8202 Km (mM) 1.2406

Ejemplo de cálculo (Sin inhibidor):

● ANÁLISIS

Para determinar el efecto del sustrato y efecto del inhibidor (oxamato) sobre la actividad enzimática de la oxidorreductasa LDH, se emplearon concentraciones crecientes de piruvato, esto porque la reacción que cataliza la LDH es el paso de piruvato a lactato, con la oxidación del NADH, por ello éste se empleó para el seguimiento de la reacción pues funciona como un cofactor de la enzima. El lactato absorbe a una longitud de onda de 340nm por lo que se determinó la actividad leyendo a esta absorbancia.

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