PCR En Cerveceria

TIEMPO REAL CON EL USO DE PCR GeneDisc ® en Tiempo Real

De: Q.F. Magaly Rodríguez

INTRODUCCION

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una herramienta para la detección específica de un microorganismo. Mediante este procedimiento una porción conocida de ADN es amplificada in vitro para luego ser detectada.

En el campo de la cervecería, hasta hace algunos años, esta técnica molecular estaba limitada a los laboratorios de investigación debido a la necesidad de una alta especialización del analista para llevar a cabo un método tan laborioso, que era necesario que fuera así, para minimizar el alto riesgo de contaminación y los falsos positivos, por lo que prevalecieron las técnicas microbiológicas convencionales, que usan enriquecimientos, pruebas bioquímica y microscopía.

En la actualidad, con el desarrollo de kits comerciales, se reduce la posibilidad de falsos positivos y negativos, tal es así que ya se vienen usando PCR en cervecerías como Heineken, Tröegs Brewing Co., el Research Center Weihenstephan for Brewing and Food Quality, entre otras. Así mismo la técnica de PCR ha sido estandarizada para determinar la presencia de patógenos y para el mejoramiento de cepas lácticas o alcohólicas en la industria de alimentos.

METODOLOGIA PCR en Tiempo Real GeneDisc ®:

1° Protocolo de Enriquecimiento: uno de los medios de enriquecimiento indicado por Pall GeneDisc® Technologies es el medio NBB de Döhler. De acuerdo a ello y teniendo en cuenta el tipo de muestra, se utilizaron los esquemas de enriquecimiento del profesor Back.

Las muestras con levadura cosechada e inicios de fermentación se enriquecieron con 10% de NBB-B.

Las muestras de cerveza sin filtrar en maduración, pre-filtro y cerveza filtrada se enriquecieron con 5% de NBB-C.

Para el caso de cerveza filtrada en BBT y cerveza en producto terminado, se filtraron 500 mL en membrana de 0.45 u, la misma que fue colocada asépticamente dentro de la botella BVPF para luego ser enriquecida como una cerveza sin filtrar usando NBB-C.

El tiempo de enriquecimiento e incubación para todas las muestra fue entre 2-3 días, previo al análisis por PCR.

Se mantuvieron en incubación a 28°C, muestras enriquecidas en paralelo para la posterior lectura por el método microbiológico tradicional.

2° Protocolo de Extracción del ADN: se siguió el siguiente protocolo:

1.- Se transfirió 200 uL de la muestra a un tubo de lisis celular, luego se centrifugó a 10 000 g por 5 minutos, Los tubos de lisis contienen “beads” lo cual mejora la sedimentación de las células.

2.- Se retiró el sobrenadante y se descartó, esto para trabajar sobre las células adheridas en los “beads”.

3.- Se añadió el buffer de lisis para resuspender

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