Practica LAboratorio - Laboratorio de Cultivo de Tejidos

Ingeniero en Biotecnología – Laboratorio de Cultivo de Tejidos

Reporte #6

Alumno: Juan Carlos Lopez de Lara Andrade

Profesor: Dra. Irais Castillo

Torreón, México. Noviembre 22, 2016

I. Práctica 6: Ensayo de viabilidad celular

II. Introducción

Se determinaron los efectos de  las fracciones de los compuestos puros de Larrea tridentata (comúnmente conocida como “Gobernadora”) sobre la viabilidad celular a través de la evaluación de la integridad mitocondrial de la célula, mediante ensayo colorimétrico del 3-(4,5-dimetiltiazol 2yl)-2,4-difenilbromuro de tetrazolio (MTT). La absorbancia se determinó a 570 nm en un lector de ELISA Multiscan EX®.

Además, Se obtuvieron y cultivaron células mononucleares (MøS) de donadores a partir de Lymphoprep™ (sustituible por Fycoll-Hypaque) gracias a la diferencia de densidad por gradiente. Utilizando estas células, se hizo una determinación de niveles de envoltura del virus dengue tipo 2 (DENV2) en MøS infectados con DENV2 por ELISA.  

III. Objetivos

• Realizar el cultivo de células de mamífero.
• Determinar los efectos antivirales sobre la viabilidad celular.

IV. Revisión de la literatura

Existen tres tipos principales de células sanguíneas mononucleares utilizadas en la lucha contra enfermedades, incluyendo leucemias, cánceres y enfermedades infecciosas. Estos incluyen linfocitos, monocitos y macrófagos.

Los linfocitos comprenden aproximadamente el 20% de los glóbulos blancos periféricos y derivan de la célula progenitora linfoide común en la médula ósea. Tienen un núcleo grande, casi esférico rodeado por una cantidad muy distinta de citoplasma. La prominencia de este núcleo regular ha llevado a que se conozcan como leucocitos mononucleares, o en términos más amplios, las células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs).

Estas células se obtienen a menudo de la sangre usando ficol, un polisacárido hidrofílico que separa capas de la sangre, con monocitos y linfocitos formando un buffy coat bajo la capa del plasma. Este buffy contiene las PBMCs.

Las PBMCs tienen vastos usos clínicos y en investigación. Por ejemplo, se emplean en la investigación del virus HIV porque las PBMCs incluyen los linfocitos T4, que el HIV infecta.

Una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC) es cualquier célula sanguínea periférica que tiene un núcleo redondo. Estas células consisten en linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos, mientras que los eritrocitos y las plaquetas no tienen núcleos, y los granulocitos (neutrófilos, basófilos y eosinófilos) tienen núcleos multilobulados.

Estas células se pueden extraer de sangre utilizando ficoll, un polisacárido hidrófilo que separa las capas de sangre, y la centrifugación en gradiente,  que separará la sangre en una capa superior de plasma, seguido de una capa de PBMCs y una fracción inferior de Células polimorfonucleares (tales como neutrófilos y eosinófilos) y eritrocitos. Las células polimorfonucleares pueden aislarse adicionalmente por lisis de los glóbulos rojos (Miyahira, 2012).

La característica más importante de estas células es su capacidad para reconocer específicamente moléculas extrañas y destruirlo. Hay 3 poblaciones principales de linfocitos:

1. Célula T (derivada del timo)

La superficie celular contiene receptores tipo anticuerpo que ven fragmentos de antígenos en la superficie de células infectadas o cancerosas.

2. Célula B (derivada de la médula ósea)

Produce anticuerpos que esencialmente emboscan antígenos extraños que circulan en el torrente sanguíneo.

3. Natural Killer (células NK)

Jugadores importantes en el brazo innato del sistema inmunológico. Proporcionan una defensa temprana contra patógenos y células transformadas con tumores.

Hay otras PBMCs en humanos:

1. Los monocitos, que se convierten en macrófagos, absorben y digieren el patógeno y presentan fragmentos en sus superficies como una señal. La señal es recogida por otras células en el sistema inmune adaptativo.

2. Las células dendríticas son células presentadoras de antígenos con una capacidad única para inducir respuestas inmunes primarias. Capturan y transfieren información del mundo exterior a las células del sistema inmune adaptativo.

        El agente viral utilizando en esta práctica, DENV2, tiene como objetivo los macrófagos monocitos descritos anteriormente: he ahí la importancia de la obtención y el cultivo de MøS para el ensayo de viabilidad celular realizado.        

V. Desarrollo de la práctica

Obtención y cultivo de células mononucleares:

La obtención de células mononucleares se realizó a través de paquetes leucocitarios de donadores.

1. Las células mononucleares se aislaron con Lymphoprep, centrifugando a 1800 rpm durante 45 min.
2. Posteriormente cuidadosamente con una pipeta automática se tomó la fase mononuclear para continuar con los 5 lavados correspondientes con 50 mL de PBS 1X cada uno.
3. En una placa de 12 pozos se cultivaron las células mononucleares obtenidas en medio de cultivo DMEM (SIGMA™), con L-glutamina, sin SFB y se incubó 24 h a 37° C y 5% de CO2.
4. A las 24 h de incubación se descartaron células en el sobrenadante, se realizaron 2 lavados con PBS, y se incubaron las células 3 días más para su diferenciación.

Determinación de niveles de Envoltura de DENV2 en MøS infectados con DENV2 por ELISA:

1. Se forró una placa de ELISA de 96 pozos con 100µL de  buffer de carbonatos, y se colocaron 100 µL de la muestra del día dos de cosecha del tratamiento con cada compuesto correspondiente.
2. Se dejó incubar toda la noche a 4°C.
3. Posteriormente se desechó el sobrenadante y se realizaron 3 lavados con PBS-Tween.
4. Se realizó el bloqueo con leche descremada al 3% dejando incubar a temperatura ambiente por 30 min.
5. Al término de la incubación se desechó por inversión la leche y se colocó el anticuerpo primario anti-Env (Santa Cruz Biotechnologies) a una concentración 1:500 en leche descremada al 1%, se incubó durante 1.5 h a 37°C.
6. Al término de la incubación se realizaron 3 lavados con PBS-Tween para posteriormente adicional la proteína A-HRP (Santa Cruz Biotechnologies) a una concentración de 1:500 y se incubó durante 1.5 h.
7. Posteriormente se descartó el sobrenadante y se realizaron de igual manera 3 lavados con la misma solución para agregar el sustrato  por 30 min a temperatura ambiente en oscuridad.
8. Después se agregó una solución “stopping” para parar la reacción y se leyó a 540 nm en un lector de ELISA.

Ensayo antiviral:

Para la citotoxicidad y los ensayos antivirales, se preparó una solución “STOCK”tanto de fracciones como de compuestos a una concentración de 1000 ug/mL.

1. Se pesaron 0.001 g de compuestos puros de Larrea tridentata, disolviendo con 100 µL de dimetil sulfóxido (DMSO) (SIGMA™) y se llevó a 1000 µL con PBS.
2. Los extractos se esterilizaron mediante filtración (Filtro Millex® 0.22 µm).
3. Para determinar la actividad antiviral de los extractos metanólicos de las especies en estudio, se cultivaron 100,000 células BHK 21 por pozo, en una placa de 12 pozos.
4. Las células se dejaron en una incubadora (Napco Series 5400) con 5% CO2.
5. Después de las 24 h, las células se trataron con la DMNT para cada extracto.
6. Posteriormente las células  se trataron bajo diferentes condiciones; control de células (Sólo células con medio), control de virus  (células con 40 000 partículas virales) DENV2  y control de extracto (células y extracto a su DMNT) y preincubación.
7. Se incubó por una hora al DENV2 con el compuesto/fracción a su DMNT y posteriormente se inoculó a las células con el preincubado y se incubó una hora con 5% CO2.
8. Se observó al microscopio para evaluar efecto citopático cada 24 h durante 3 días.

Se anexa a este documento un diagrama de flujo correspondiente al desarrollo de la práctica.

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