Práctica de fluorescencia Molecular

Práctica de fluorescencia Molecular

INTRODUCCIÓN

Fenómeno de Luminiscencia

La luminiscencia es la propiedad que presentan algunos materiales y seres vivos de emitir luz cuando son sometidos a determinada temperatura. La luminiscencia comprende las emisiones de luz visible producidas tanto por la acción de ciertos rayos como por la existencia de reacciones físicas o químicas. Se excluye la radiación originada exclusivamente como consecuencia del calor.

Dependiendo de la energía que la origina, es posible hablar de varias clases de luminiscencia: fotoluminiscencia (como fluorescencia y fosforescencia), termoluminiscencia, quimioluminiscencia, triboluminiscencia, electroluminiscencia y radioluminiscencia.

La fotoluminiscencia se define como la emisión de luz que es consecuencia de la absorción previa de una radiación, ejemplos de fotoluminiscencia son la fosforescencia y la fluorescencia. La fluorescencia es la luminiscencia causada única y exclusivamente por rayos ultravioleta. El término fluorescencia proviene del mineral que presenta este fenómeno por naturaleza, la fluorita. Cuando la luminiscencia continúa un cierto tiempo aunque se elimine la fuente de excitación, se habla de fosforescencia. Existen materiales que, a pesar de haberles retirado la fuente energética que incide sobre ellos, continúan emitiendo luz durante una fracción de segundo.

Al tener mayor estabilidad del estado triplete excitado, el tiempo de vida de la fosforescencia es mayor que el tiempo de vida de la fuorescencia, por lo tanto es mucho más fácil medirlo y esto nos permite utilizar una instrumentación más sencilla para llevar a cabo la medida.

Debido a la posibilidad de medir la fosforescencia tras un tiempo después de realizar la excitación, podemos medir después de que interferencias que podrían emitir flerorescencia se desactiven y así discriminar mucho mejor la señal de la sustancia emisora, obteniendo mejor relación Señal/Ruido.

Cuanta mayor diferencia exista entre la longitud de onda de emisión y la de excitación habrá mayor discriminación entre ambos procesos.

A pesar de éstas ventajas, la mayor desventaja de medir fosforescencia es que es un fenómeno poco común, por tanto hay pocas sustancias fosforescentes. Además, está muy influenciada por distintos parámetros, como son: la temperatura, la presencia de un átomo pesado (mayor posibilidad de transición), la presencia de oxígeno (produce desactivación no radiacional de la fosforescencia), rigidez de la especie (se puede conseguir mediante la inmovilización sobre un soporte sólido).

Quantum Dots

        Los quantum dots son estructuras tridimensionales de tamaño nanométrico, que tienen propiedades optoelectrónicas importantes. Están formadas por nanocristales de semiconductores inorgánicos formado por elementos de los grupos II-VI, III-V, IV-VI. La distribución de niveles electrónicos que poseen hacen que resulte muy facil la conducción de los electrones libres que poseen intrínsecamente los elementos que los forman. Actualmente están en desarrollo  y se están realizando muchos avances en su toxicidad, sus aplicaciones y su inminente futuro como marcadores en ensayos inmunológicos.

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

La práctica se divide en dos sesiones, que se desarrollarán en dos días distintos:

Sesión 1.: Evaluación de las características espectrales.

En primer lugar se llevará a cabo la medida de la señal de fosforescencia de 3 distintos fluoróforos:

• Molécula fosforescente orgánica tradicional : 1-naftilacetamida.
• Nuevos materiales: Quantum Dots de ZnS (QDs ZnS) y Quantum Dots de ZnS dopados con Manganeso (QDs ZnS:Mn).

y se evaluará el efecto de la presencia de determinados componentes químicos que típicamente afectan a las señales de emisión fosforescente (Ej.: presencia de oxígeno disuelto, presencia de un átomo pesado, etc):

• (I). Medida en presencia de sulfito sódico (Na2SO3) 4mM. Sirve para desoxigenar la disolución y evitar la desactivación no radiacional. Se forman iones sulfato, que al ser incoloros no interfieren en la medida.
• (II). Medida en presencia de yoduro potásico (KI) 1M. Que al ser un átomo pesado favorece la transición haciendo más fácil la fosforescencia.
• (III). Medida en presencia de sulfito sódico 4mM  y Yoduro potásico 1M (Na2SO3 + KI).

Sesión 2.: Relación de la Intensidad de fosforescencia con distintos factores.

A la disolución que se haya observado en la primera sesión que emita fosforescencia, se estudiará el efecto producido por la presencia de acetona.  Se añadirán alícuotras de 10 μL de una disolución de acetona de 99.5% de pureza.

Para ello se hará un estudio de la variación de las intensidades de emisión, que se ajustan a una respuesta tipo Stern-Volmer. Posteriormente se realizará un estudio de tiempos de vida, para poder distinguir entre una desactivación estática y dinámica de la fosforescencia.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Sesión 1.: Evaluación de las características espectrales.

Disoluciones disponibles

• 50 mL de NAD de 50 mg/L en etanol.
• 50 mL de QDs ZnS de 50 mg/L en reguladora de borato a pH=9.
• 50 mL de QDs ZnS:Mn de 50 mg/L en reguladora de borato a pH=9.

Disoluciones a preparar

• 25 mL de KI 2M.                 [pic 1]

Para preparar una mezcla con la sustancia fluorescente para dar una conc. final de 1M:

[pic 2][pic 3]

• 50 mL de Na2SO3 0.1M.

[pic 4]

Para preparar una mezcla con la sustancia fluorescente para dar una conc. final de 0.004 M:

[pic 5][pic 6]

[pic 7]

• 5 mL de NAD de 1 mg/L.

[pic 8]

• 3 mL de QDs ZnS de 16.7 mg/L.

[pic 9]

• 3 mL de QDs ZnS:Mn 16.7 mg/L.

Hay que preparar distintas disoluciones de las diferentes partículas fosforescentes solas; con KI; con Na2SO3; y con ambos.

Condiciones de medida

Inicialmente se lleva a cabo un barrido de excitación, para optimizar la longitud de onda de excitación, que normalmente se escoge 35-40 nm por encima de la emisión de la fuente del equipo, para evitar interferencias instrumentales (El procedimiento se explicará más adelante). Otro parámetro a controlar es la rendija de excitación, (cuanto más amplia es, más luz llega al detector, pero si es demasiado grande, podemos estar incluyendo la emisión procedente de la fuente, por ello hay que establecer un compromiso).

El tiempo de adquisición de datos o Averaging time también se puede controlar, cuanto más tiempo de adquisición, más barridos realizará el equipo, por tanto la señal final será el promedio de más medidas, lo que disminuirá el ruido de la medida, pero tardará más en realizar cada medida. Dentro de éste tiempo de adquisición de datos o total decay time, se incluye el Delay, el Gate y el tiempo de espera entre una medida y la excitación de la fuente en la siguiente medida. El Delay es el tiempo que pasa desde que se apaga la lámpara y se comienza a medir (0.12 ms). Esto se lleva a cabo para evitar la emisión fluorescente del analito o de interferentes presentes en la muestra. El Gate corresponde al intervalo de tiempo durante el cual se lleva a cabo la medida de la fosforescencia (5 ms).  Estos tres parámetros se observan más claramente en la siguiente figura:

[pic 10]

Otro de los aspectos a optimizar es el detector, que al ser un fotomultiplicador, se puede aumentar la señal ampliando el voltaje (y viceversa). El problema es que al aumentar el voltaje se aumenta tanto la señal del analito, como el ruido.

Para encontrar las longitudes óptimas de excitación de la especie fosforescente y la longitud de onda óptima de emisión en la que se recoge la señal procedente de la emisión fosforescente de dicha muestra, se lleva a cabo un estudio preliminar. Inicialmente, excitamos a 287 nm y barremos de 350-600 nm. Una vez encontrado la longitud de onda máxima de emisión, recogemos la emisión a esa longitud de onda (519 nm) barriendo la excitación desde 250-500 nm. Seguimos realizando éste proceso iterativo hasta no encontrar variación en la intensidad de la señal máxima.

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