Transformación de E. Coli con ADN plasmídico

Trabajo Práctico Nº 4: Transformación de E. Coli con ADN plasmídico.

Objetivos

Transformar bacterias competentes de E. Coli utilizando DNA plasmídico obtenido en el TP Nº 2.

Introducción

Mediante ciertas técnicas de laboratorio de degradación parcial de membrana plasmática y pared celular de bacterias es posible que integren a su citoplasma plásmidos que están en solución. Estos plásmidos pueden contener secuencias que codifiquen para proteínas que le proporcionen a la bacteria un valor adaptativo positivo por ejemplo un gen de resistencia al antibiótico ampicilina. Para verificar la presencia del plásmido en las bacterias pueden ser cultivadas en un medio (agar en el caso de nuestro tp) con ampicilina y observar la cantidad de colonias que fueron formadas luego de darle las condiciones favorables a las bacterias para que se dividan y reproduzcan.

Desarrollo del Tp

Recibimos 3 tubos eppendorf con 50 microlitros(c/u) de bacterias en hielo hechas competentes por tratamiento con CaCl2 . Luego otros tubos con plásmido control de concentración conocida preparado por los docentes y un tubo con el plásmido preparado por nuestro grupo. Utilizaremos el plásmido PBluescript II obtenido en el TP “Extracción de DNA plasmídico”. Luego en un tubo incorporamos 5 microlitros de agua, en otro (por un error de pipeteo) 15 microlitros de plásmido control y en otro 5 microlitros de plásmido extraído anteriormente y dejamos los tubos en hielo por 20 minutos seguido de un shock térmico a 42°C por 1 minuto y medio. En ese momento, la combinación de Ca2+ y temperatura hace que se formen poros en la membrana plasmática de las bacterias que permiten que el DNA plasmídico entre a las células. Luego pusimos los tubos nuevamente en hielo para que se enfríen y incorporamos 950 microlitros de LB líquido para darle a las bacterias tiempo de  recuperación sin antibiótico a 37°C. Este paso permite que las células se estabilicen y comiencen a expresar el gen de resistencia al antibiótico antes del plaqueo en un medio de cultivo adicionado con el antibiótico correspondiente

Plaqueamos la suspensión de bacterias en placas de LB sólido conteniendo ampicilina (100 g/ml) y dejamos las placas incubando a 37°C para observar los resultados en laclase siguiente.

Realizamos tres controles

Control de viabilidad: plaqueando las células en LB sin antibiótico (solo dos grupos)

Control negativo: transformando las células con agua estéril y plaqueando en LB con ampicilina

Control positivo: transformando las células con una masa conocida de un plásmido conocido.

Realizamos el cálculo de eficiencia de las bacterias a ser transformadas de la placa 2:

Anexo

1. ¿Qué información se obtiene de las placas correspondientes a los tubos 1, 2 y 3? ¿Y

del control de viabilidad?

El tubo 1 es el control negativo en el que las bacterias se transformaron sin plásmido y debería no haber colonias en la placa ya que esta tiene ampicilina.

El  tubo 2 era el control positivo ya que las bacterias fueron transformadas con una masa de plásmido conocida para reconocer si realizamos bien el plaqueo y el procedimiento.

El tubo 3 era el del plásmido que extrajimos anteriormente y observaremos la eficiencia de transformación.

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