Determinación de la pureza de una muestra de la TsGST mediante electroforesis SDS-PAGE

Práctica 3. Práctica 3. Determinación de la pureza de una muestra de la TsGST mediante electroforesis SDS-PAGE

Objetivos

1. Preparar un gel de poliacrilamida discontinuo y desnaturalizante

2. Manipular muestras proteicas para someterlas a electroforesis

3. Determinar el peso molecular de bandas proteicas

4. Determinar la pureza de una muestra de GST de T. solium 

Introducción

El término electroforesis se refiere al movimiento de moléculas cargadas en respuesta a un campo eléctrico, lo que causa su separación. Los factores que afectan la electroforesis de proteínas incluyen la fuerza del campo eléctrico, la temperatura del sistema, el pH, el tipo de iones usados y la concentración del amortiguador, así como el tamaño, forma y carga de la proteína. Cuando la electroforesis se realiza en geles de poliacrilamida (PAGE, Polyacrylamide Gel Electrophoresis), el gel sirve como un tamiz selectivo de tamaño durante la separación. Como las proteínas se mueven a través del gel en respuesta al campo eléctrico, el tamaño del poro del gel permite a las proteínas más pequeñas viajar más rápidamente que las proteínas más grandes, cubriendo un intervalo de 5 a 250 kDa. Habitualmente, el gel está orientado verticalmente entre 2 cámaras con amortiguador y el único camino eléctrico entre las 2 cámaras es a través del gel. La aplicación del campo eléctrico a través de estos amortiguadores fuerza la migración de proteínas dentro y a través del gel. Pueden usarse 2 tipos de sistemas de amortiguadores, el continuo y el discontinuo. El sistema continuo usa el mismo amortiguador a pH constante en el gel, la muestra y las cámaras. El sistema discontinuo utiliza un gel separado en 2 secciones: un gel concentrador o proteínas de forma que les confiere una carga negativa global; la carga por unidad de masa es prácticamente constante para todas las proteínas porque el SDS se une a una estequiometría cercana a una molécula de SDS por cada 2 residuos de aminoácidos. Como resultado, la tasa a la cual la proteína unida al SDS migra en un gel, dependerá principalmente de su tamaño, permitiendo la estimación del peso molecular (Fig. 1). Además del SDS en el amortiguador de muestra, se utilizan agentes reductores de grupos tiol, como el 2-mercaptoetanol, que rompen puentes disulfuro intermoleculares e intramoleculares, para alcanzar un desplegamiento completo proteíco y mantener a las proteínas en estado reducido.

La poliacrilamida es un gran polímero de acrilamida con un co-monómero entrecruzante o cross-linker, la bisacrilamida. La polimerización se inicia con persulfato de amonio (PSA), que crea radicales libres y empieza la reacción en cadena que unirá a todas las moléculas de acrilamida, mientras que el tetrametiletilenediamino (TEMED) actúa como catalizador, estimulando la formación de radicales libres durante la reacción. El porcentaje de poliacrilamida nos da una idea del tamaño de poro y se define como %T (concentración total del monómero en g/100 mL). Un mayor %T significa un mayor radio polímero-agua y por lo tanto, poros más pequeños. En cambio, el cross-linker tiene un porcentaje óptimo, el cual está entre el 3 y el 5% del total.

Material y equipo

1 Cámara de electroforesis Mini-Protean® Tetra Cell (BioRad)

1 Fuente de poder PowerPac™

1 Módulo de ensamble, peine y vidrios (glass spacer plates with 1.5 mm spacers and glass short plates)

1 Agitador horizontal

1 Transiluminador de luz blanca

1 Termoblock a 95° C

1 Tubo cónico de 50 mL

1 Tubo cónico de 15 mL

1 Charola para tinción

1 Contenedor con hielo

3 Racks para micropuntas (2 a 20 µL, 20 a 200 µL y 200 a 1000 µL)

3 Micropipetas (P-1,000, P-200 y P-20)

1 Rack para tubos cónicos

Agua destilada

Marcador de peso molecular para proteínas

Acrilamida/bis-acrilamida 30:0.8

Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8

Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8

Solución SDS 10% (p/v)

N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED)

PSA al 10% (p/v)

Solución Laemmli 2X

Amortiguador de corrida 1X

Solución de Coomassie

Solución desteñidora

Protocolo

Utilice guantes en todo momento

1. Colocar los vidrios en el módulo de ensamble, acomodar el peine y hacer una marca sobre el vidrio a 0.5 cm por debajo de los dientes del peine.

2. Mezclar en un tubo cónico de 50 mL las siguientes soluciones para preparar el gel separador:

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