Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE

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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

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FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I

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+ SISTEMA DISCONTÍNUO ORNSTEIN Y DAVIS.

Fue desarrollado por Ornstein y Davis en 1964; para el análisis de proteínas del suero en estado nativo, que desde entonces ha sido aplicado a muchas otras proteínas.

Consiste en cuatro partes interrelacionadas: [pic 8]

• El gel concentrador (stacking gel).
• El gel separador (running gel).
• El amortiguador de electrodos.
• La muestra.

El gel concentrador es de poros grandes (4%t), contiene amortiguador Tris-Cl 0.125M, pH 6.8 y se prepara en la parte superior del gel separador. Este último posee valores de 5-30%T, contiene Tris-Cl 0.375M, pH 8.8. El amortiguador de los electrodos es Tris 0.025 M, Glicina 0.192M, pH 8.3. La muestra se deposita sobre el gel concentrador, diluida en amortiguador de muestra Tris-Cl 0.0625 M, pH 6.8, y es cubierta por el amortiguador del cátodo (reservorio superior). Cuando es aplicado el campo eléctrico, los aniones Cl- y glicinato, así como las proteínas cargadas negativamente, comienzan a moverse hacia el ánodo. El Tris y otros cationes se mueven hacia el cátodo. Como la μeff (movilidad efectiva) del Cl- es mayor que la de la glicina a pH 8.3, dado que el pKa de la glicina es 9.8, se forma una región de baja conductividad y alto campo eléctrico detrás del frente de movimiento del Cl-. [pic 9]

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Esto acelera el movimiento de las proteínas de la muestra y del frente de movimiento de la glicina a la misma velocidad del frente del Cl-. Se forma un arreglo de frentes en movimiento, con el Cl- al frente, la glicina en la retaguardia, y las proteínas en varios frentes comprimidos entre ambos. Esto ejerce un efecto de concentración de las proteínas que pueden llegar a alcanzar concentraciones de 100mg/ml. El pH del gel concentrador asciende a 8.3 en la medida que la glicina se mueve a través de él. Dado que el gel concentrador posee poros grandes, no ejerce efecto de tamiz, y las proteínas avanzan solo dependiendo del efecto del campo eléctrico. Cuando los frentes atraviesan el gel concentrador y entran en el gel separador, la menor porosidad de este sí ejerce efecto de tamiz, resistiéndose al paso de las proteínas en dependencia de su masa molecular. Como este es un sistema en condiciones nativas, también la forma influye en la movilidad electroforética. A lo anterior debe añadirse qué al penetrar las proteínas en el gel separador, experimentan un cambio del pH del medio, de 8.3 a 8.8, el que luego asciende a 9.5 cuando el amortiguador Tris-Cl es sustituido por Tris-glicina. Este es el valor de pH al ocurre la separación de los componentes de la muestra en bandas discretas.[pic 11]

Una vez que alcanzan el gel separador, las proteínas quedan libres del gradiente entre glicina y cloruro que las “atrapa”, debido a que al pH del gel concentrador la glicina tiene principalmente carga negativa (aunque mantiene carga positiva) y ambas (glicina y cloruro) se desplazan rápidamente hacia el ánodo.

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+ MODIFICACIÓN POR LAEMMLIN.

En 1970 Laemmlin modificó el sistema de Ornstein-Davis para usarlo en la estimación del peso molecular de las proteínas. Incorporó el detergente aniónico dodecil-sulfato de Na (SDS) al 0.1% en los amortiguadores del sistema de Ornstein-Davis, y adicionó un paso de desnaturalización al calor en presencia de 0.2% de SDS y 2-mercaptoetanol al 5%. En tales condiciones, los enlaces S-S de las proteínas se reducen, y estas se desnaturalizan totalmente. El SDS se asocia a estas en una relación de 1.4g de SDS por gramo de proteína. Las propiedades del SDS se hacen dominantes sobre las de las proteínas, estas adoptan una conformación extendida, similar a bastoncillos, con dimensiones proporcionales a su masa molecular. En adición, la densidad de carga del complejo SDS-proteína es independiente del pH en el rango de 7 a 9.

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+ PAPEL DE LOS REACTIVOS.

• Acrilamida y N,-N’metilenbisacrilamida: La acrilamida es el monómero fundamental para formar el gel. La acrilamida es un compuesto vinílico y, como tal, es susceptible a la polimerización por vía radicálida. La acrilamida es soluble en agua, no es un compuesto con gran toxicidad aguda, pero en una exposición laboral o exposición continua tiene un efecto acumulativo, es cancerígena (en especial puede inducir cáncer de piel), teratógena y es un neurotóxico. Una vez polimerizada, la poliacrilamida resultante es inocua, ya que ha perdido los grupos vinilo altamente reactivos.

Por otra parte, el N,N’-metilenbisacrilamida es el agente responsable del entrecruzamiento de las cadenas de poliacrilamida y la reticulación del gel. Es esencial para regular las propiedades mecánicas y la capacidad de separación del gel.

• Dodecilsulfato de sodio: Su papel es la desnaturalización y el establecimiento de una relación carga-tamaño constante en la proteína, de modo que la movilidad de la proteína durante la electroforesis sea exclusivamente proporcional a su peso molecular. El resultado global de formar un complejo SDS-proteína es que la velocidad de desplazamiento de la proteína en el campo eléctrico es inversamente proporcional al peso molecular.

• BufferTris para preparar gel de resolución: El pH debe ser alcalino, para que todos los grupos fosfato del DNA estén ionizados por completo y éste se mantenga cargado negativamente. La composición habitual es Tris 40 mM, ác. acético 19 mM, EDTA (ácido etilendiamino tetraacético)1 mM, pH=7,5. En la electroforesis, permite mantener las moléculas de DNA con una carga negativa uniforme y constante. Es, por ello, componente del gel y del tampón de electroforesis, o tampón de cubeta.

• TEMED y persulfato: Son la clave del mecanismo de polimerización via radicales libres. generan los radicales necesarios para iniciar la reacción, que prosigue en cadena hasta formar el hidrogel.

• Bufferde electroforesis Tris-glicina: Permite la conducción eléctrica y contiene componentes fundamentales en la separación: la glicina y el Tris-HCl

+ CONDICONES DE VOLTAJE Y PAPEL DEL LOS IONES.

A bajo voltaje la velocidad de migración de las proteínas es proporcional al voltaje aplicado. Pero en la medida que el campo eléctrico es intensificado, la movilidad de las partículas de alto peso molecular comienza a no corresponder proporcionalmente al incremento del voltaje. Como consecuencia, el rango efectivo de separación en el gel de agarosa disminuye con la elevación del voltaje. Las condiciones de voltaje que deben ser aplicadas dependen del gel y de la muestra que se desee analizar.

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