Electroforesis en gel de poliacrilamida

Objetivos.

• Separar mediante la electroforesis muestras de suero, yogurt y clara de huevo.
• Determinar el tamaño óptimo de poro para una correcta separación.

Fundamento

La electroforesis es un método de separación, en el cual, una muestra se hace migrar por acción de un campo eléctrico. Esta definición nos ofrece dos posibilidades, electroforesis libre o de frente móvil, no requiere soporte sólido, además, solo mantiene separadas los componentes mientras el campo eléctrico sea aplicado y la electroforesis de zona, que requiere un soporte solido poroso y una vez retirado el campo eléctrico se mantendrán separados los componentes. Para la última, los soportes son diversos, esta práctica se utilizó gel de poliacrilamida. Este gel se compone de 2 segmentos, un gel empacador y un gel separador. El primero, tiene un tamaño de poro menor su trabajo es el concentrar la muestra para obtener mejores y más detalladas bandas.

La obtención de este gel necesita un soporte o molde inerte, un marco de vidrio, en el cual se lleva a cabo la polimerización mediante la reacción de los monómeros, la acrilamida y N,N’ metilen-bis- acrilamida. Los monómeros del gel por si mismos no polimerizan, se requieren catalizadores, para lo cual usamos persulfato de amonio y tetrametiletilendiamina (TEMED). La polimerización se dará por un mecanismo vía radical libre y en la reacción debe cuidarse la presencia de oxigeno pues inhibe la polimerización. Suele evitarse esto con la adición superficial de agua a la reacción. [pic 1][pic 2][pic 3]

El copolímero formado tendrá estructura tridimensional de red gracias a que, la acrilamida al polimerizar, forma estructuras lineales y la N,N’ metilen-bis-acrilamida forma entrecruzamientos en las mismas, por tanto, esta última determinara el tamaño del poro en nuestro gel, a mayor concentración de bis-acrilamida, menor tamaño de poro y esto, de denota en el gel como %T, que es la concentración relativa de los polímeros.

[pic 4]El tamaño de poro a usar determinará el grado de separación, sin embargo, menor poro no quiere decir mejor separación, esto será dependiente de la composición de la mezcla a separar. Pues si la muestra tiene proteínas muy grandes, un poro muy grande no las separará, pero un poro muy grande nos dará bandas muy próximas y difíciles de distinguir.  

Por último, la muestra debe cumplir determinadas características, como, por ejemplo, tener carga, esto en el caso de las proteínas se logra modificando en pH a uno donde todas las proteínas tengan carga, en este caso negativa para que migren de cátodo a ánodo. También es necesario agregar a la misma un colorante para poder observar la migración de la electroforesis. Dicho colorante debe de ser de tamaño molecular sumamente pequeño y de la misma carga que la muestra, para asegurar que migre por delante de todas las moléculas y en la misma dirección.

[pic 5][pic 6]Resultados.

[pic 7][pic 8]

[pic 9][pic 10]

[pic 11][pic 12]

[pic 13]

...