PRÁCTICA 2: SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS POR CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

PRÁCTICA 2:  SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS POR CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

OBJETIVO

Por medio de la cromatografía en capa fina, se realizara la separación de fosfolípidos presentes en la clara de huevo.

INTRODUCCIÓN 
Los lípidos, son un grupo de compuestos químicamente diversos, solubles en solventes orgánicos (como cloroformo, metanol o benceno), y casi insolubles en agua. La mayoría de los organismos, los utilizan como reservorios de moléculas fácilmente utilizables para producir energía (aceites y grasas). Los mamíferos, los acumulamos como grasas, y los peces como ceras; en las plantas se almacenan en forma de aceites protectores con aromas y sabores característicos. Los fosfolípidos y esteroles constituyen alrededor de la mitad de la masa de las membranas biológicas. Entre los lípidos también se encuentran cofactores de enzimas, acarreadores de electrones, pigmentos que absorben luz, agentes emulsificantes, algunas vitaminas y hormonas, mensajeros intracelulares y todos los componentes no proteicos de las membranas celulares.

Los lípidos, pueden ser separados fácilmente de otras biomoléculas por extracción con solventes orgánicos y pueden ser separados por técnicas experimentales como la cromatografía de adsorción, cromatografía de placa fina y cromatografía de fase reversa.

 La función biológica más importante de los lípidos es la de formar a las membranas celulares, que en mayor o menor grado, contienen lípidos en su estructura. En ciertas membranas, la presencia de lípidos específicos permite realizar funciones especializadas, como en las células nerviosas de los mamíferos. La mayoría de las funciones de los lípidos, se deben a sus propiedades de autoagregación, que permite también su interacción con otras biomoléculas. De hecho, los lípidos casi nunca se encuentran en estado libre, generalmente están unidos a otros compuestos como carbohidratos (formando glucolípidos) o a proteínas (formando lipoproteínas).1

Las mezclas complejas de lípidos de membrana se pueden separar por procedimientos cromatográficos como la cromatografía de capa fina, también llamada TLC (Thin Layer Chromatography). Este procedimiento, al igual que la extracción de lípidos, se basa en la polaridad relativa de estas moléculas. Para la TLC se utiliza una matriz de un material insoluble y polar, como la sílica gel (que es una forma de ácido silícico Si(OH)4), la cual es esparcida en una capa fina sobre un soporte que para el caso de separación de lípidos es generalmente vidrio.

A medida que el solvente sube por la placa por capilaridad, va arrastrando a los lípidos. Los lípidos polares se unirán fuertemente a la sílica, mientras que los lípidos neutrales no serán retenidos. La separación ocurre por una interacción entre los lípidos y la sílica y su solubilidad relativa en los solventes utilizados. Los lípidos una vez separados pueden ser detectados en las placas de TLC mediante distintos métodos de tinción. Las moléculas que actúan como reveladores reaccionan con diferentes componentes de los lípidos, como los dobles enlaces de los ácidos grasos, el fósforo o los grupos amino de la cabeza polar. Las diferentes especies lipídicas son identificadas en base a su migración relativa en las placas.2

Cromatografía Generalidades

Una placa de TLC consiste en una fase estacionaria (generalmente sílica) la cual es inmovilizada sobre una superficie plana (vidrio, metal, plástico). Las muestras, ya sea un líquido o un sólido disuelto en un solvente volátil, son depositadas sobre la fase estacionaria. Los constituyentes de la muestra pueden ser identificados corriendo en paralelo estándares. Un lado de la placa se pone en contacto con el solvente contenido en un reservorio, y el solvente se moverá hacia arriba de la placa por acción capilar. Cuando el frente del solvente alcanza el otro extremo de la fase estacionaria, la placa es removida del reservorio. Los compuestos separados pueden ser visualizados por diversos métodos. Los componentes de una mezcla pueden ser separados por TLC debido a que éstos pueden tener diferentes coeficientes de partición entre la fase móvil y la fase estacionaria.

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