Cinetica enzimatica TALLER CINETICA ENZIMÁTICA

TALLER CINETICA ENZIMÁTICA

1. Para una enzima (5 μM) se reportaron las siguientes velocidades iniciales, según la concentración del sustrato:

[pic 1][pic 2]

1. Dibuje la gráfica de Michaelis-Menten para esta enzima.

[pic 3]

1. Dibuje la gráfica de Lineweaver-Burke para esta enzima.

[pic 4]

1. Determine la KM y la Vmax

1. Para la gráfica de Michaelis-Menten

Es imposible obtener un valor exacto a partir de una representación de Michaelis-Menten. Como la Km es la concentración de sustrato a la que la velocidad es semimáxima (Vmax/2), también resulta imposible determinar con precisión el valor de Km.

1. Para la gráfica de Lineweaver-Burke[pic 5]

 [pic 6]

[pic 7]

[pic 8]

 [pic 9]

[pic 10]

[pic 12][pic 11]

[pic 13]

[pic 14]

[pic 16][pic 15]

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[pic 18]

 [pic 19]

[pic 20]

[pic 21]

[pic 22]

1. Indique en ambas gráficas (a & b), dónde se reconocen la Vmax y KM.

1. Gráfica de Michaelis-Menten

[pic 23]

1. Gráfica de Lineweaver-Burke

[pic 24]

1. Calcule la constante catalítica y la eficiencia catalítica de esta enzima.[pic 25]

[pic 26]

[pic 27]

   [pic 28]

[pic 29]

[pic 30]

[pic 31]

2- Usted está tratando de reproducir los resultados experimentales que obtuvo un estudiante que trabajó en su laboratorio. Él ha reportado que la enzima de interés tiene una kcat de 1875 s-1 y una eficiencia catalítica de 7.5x107 M-1 s-1.

1. ¿Cuál es la KM de esta enzima?

1. En la repetición de las mediciones, usted quiere obtener una Vmax de 10 mM s-1. ¿Cuánta enzima debe usar?, dé el resultado en μM.

1. Calcule a qué concentraciones de sustrato en μM usted debe medir la tasa inicial V0 para obtener los siguientes valores:

[pic 32]

1. Kcat = 1875 s-1                    Eficiencia = 7.5×107 M-1 S-1

[pic 33]

           [pic 34][pic 35]

  =  2.5×10-5 M[pic 36]

1. Kcat =            [pic 39][pic 37][pic 38]

   = 5.33×10-3 mM[pic 40]

5.33×10-3 mM =  5.33μM[pic 41]

1. V0 = Vmáx [pic 42]

V0 (Km +[S]) = Vmáx * [S]

V0 * Km + V0 * [S] = Vmáx * [S]

V0 * Km = Vmáx * [S] - V0 * [S]

[S] = [pic 43]

[S] = [pic 44]

1. a) [S] = 8.33×10-3mM  8.33 μM[pic 45]

1. b) [S] = [pic 46]

[S] = [pic 47]

S] = 0.02045mM  20.45 μM[pic 48]

1. c) [S] = [pic 49]

[S] = [pic 50]

S] = 0.0375mM  37.5 μM[pic 51]

1. d) [S] = [pic 52]

[S] = [pic 53]

S] = 0.225mM  225 μM[pic 54]

1. Cree una gráfica predictiva de Michaelis-Menten para su enzima.

[pic 55]

1. Cree una gráfica predictiva de Lineweaver-Burke para su enzima.

[pic 56]

3- En la tabla se presenta la hidrólisis de lactosa por la actividad de la β-galoctosidasa. Grafique los siguientes datos para las funciones v = f(s), 1/v =f (1/s) y s/v=f(s) y determine de las gráficas los valores de Vmax y Km según la tabla y compare los valores obtenidos.

[pic 57]

[pic 58]

[pic 59]

[pic 60]

Cálculos de KM y Vmáx

F(x)= mx+b                                 m=[pic 61]

F(X)= 1/Vo                    

M= KM/Vmáx                              m=[pic 62]

B= 1/Vmáx                                  m=0.0344

1/Vo-mx=b                                  

(3.57143) -(0.0344 x 100)=b      

B=0.13143                                  

Vmáx= 1/b

Vmáx= 1/0.13143

Vmáx= 7.61

KM= mVmáx

KM= (0.0349)(7.61)

KM= 0.262 

Conclusión:

Se puede decir que el proceso de linealización, específicamente la gráfica de Lineweaver-Burk presenta ciertos márgenes de error, debido a que obtuvimos datos experimentales y si seleccionamos datos aleatorios para formar la pendiente, no dará igual, da muy cercana, pero no la misma. Asimismo, es más fácil determinar el KM en una gráfica de Michaelis Menten, pues esta es igual a ½ de la velocidad máxima, siendo esta última donde encuentra una especie de equilibrio. Aunque, por facilidad, es más fácil interpretar valores linealizados que valores en forma de parábola con asíntotas.

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