Cromatografía bidimensional de aminoácidos de jugo de fruto en capa fina

FUNDAMENTO

La cromatografía se basa en la separación de los componentes de las mezclas a medida que son transportadas por un fase fluida móvil a través de una fase estacionaria sólida o líquida, la separación de las moléculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y esta separación se puede realizar en función de sus cargas, masas, tamaños moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox.

La retención y la selectividad en la separación dependen de los valores respectivos de las constantes de los diferentes equilibrios químicos que tienen lugar y que están en función de:

La polaridad del compuesto, determinada por el número y naturaleza de los grupos funcionales presentes. Los solutos más polares quedaran más retenidos puesto que se adsorben más firmemente a centros activos de la fase estacionaria, mientras que los no polares se eluiran con mayor facilidad.

La naturaleza del disolvente y para un compuesto, un aumento en la polaridad del disolvente facilita su desplazamiento en la placa.

Y para mejorar una separación incompleta, se combinan dos pasos de cromatografía monodimensional, dando lugar a la Cromatografía en plano bidimensional, que se refiere al proceso cromatográfico que hace que los componentes migren primero en una dirección y luego en otra perpendicular a ella, las dos eluciones se llevan a cabo con eluyentes diferentes.

Dado que cada compuesto migra a una velocidad característica en un sistema de solventes determinado, la segunda cromatografía incrementa en grado sustancial la separación de la mezcla en sus componentes.

RESULTADOS

Cálculos de Rf (Ejemplo)

Rf=(Frente del soluto)/(Frende del disolvente) 〖Rf〗_Arg=1.3/7.9=0.164

Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las 2 fases móviles.

Aminoácido 1a fase móvil 2ª fase móvil

Frente del soluto Frente del disolvente Rf Frente del soluto Frente del disolvente Rf

Lisina (Lys) 1.1 7.8 0.141 0.9 7.5 0.12

Arginina (Arg) 1.3 7.9 0.164 1.2 7.6 0.157

Prolina (Pro) 3.7 7.8 0.474 2.2 7.5 0.426

Glicina (Gly) 4.0 7.9 0.506 2.4 7.5 0.32

Histidina (His) 5.1 7.9 0.645 1.1 7.5 0.146

Glutamato (Glu) 5.1 7.8 0.653 2.8 7.5 0.373

Treonina (Thr) 5.4 7.8 0.692 2.8 7.5 0.373

Tirosina (Tyr) 6.2 7.8 0.794 4.5 7.5 0.6

Metionina (Met) 6.4 7.8 0.820 4.2 7.6 0.552

Fenilalanina (Phe) 7.0 7.9 0.886 4.8 7.5 0.64

Tabla 2. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases móviles.

No. de mancha 1a fase móvil 2ª fase móvil Aminoácido correspon-diente

Frente del soluto Frente del disolvente Rf Frente del soluto Frente del disolvente Rf

10 1.0 8.1 0.123 0.8 7.7 0.103 Lisina

9 1.4 8.1 0.172 1.3 7.7 0.168 Arginina

8 3.4 8.1 0.419 2.1 7.7 0.272 Prolina

7 7.8 8.1 0.469 2.2 7.7 0.285 Glicina

5 4.6 8.1 0.567 2.2 7.7 0.285 Histidina

4 5.2 8.1 0.641 2.6 7.8 0.333 Glutamato

2 5.6 8.1 0.691 4.5 7.8 0.576 Treonina

3 5.8 8.1 0.716 4.1 7.8 0.525 Tirosina

6 5.8 8.1 0.716 1.4 7.8 0.179 Metionina

1 6.4 8.1 0.79 4.8 7.8 0.615 Fenilalanina

Tabla 3. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las 2 fases móviles.

No. de mancha 1a fase móvil 2ª fase móvil

Frente del soluto Frente del disolvente Rf Frente del soluto Frente del disolvente Rf

9 1.4 7.7 0.181 1.2 7.4 0.162

8 3.2 7.7 0.415 3.6 7.4 0.486

7 3.4 7.7 0.441 2.1 7.4 0.283

6 3.6 7.7 0.467 2.7 7.4 0.364

5 3.9 7.7 0.506 2.1 7.3 0.287

4 4.7 7.7 0.610 2.0 7.3 0.273

3 4.7 7.7 0.610 2.7 7.3 0.369

2 6.3 7.7 0.818 3.9 7.3 0.534

1 6.7 7.8 0.858 4.8 7.3 0.657

Tabla 4. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las 2 fases móviles.

No. de mancha Rf creciente en la 1a fase móvil Rf en la 2ª fase móvil Aminoácido correspondiente

9 0.181 0.162 Arginina

8 0.415 0.486 Prolina

7 0.441 0.283 Glicina

6 0.467 0.364 No identificado

5 0.506 0.287 Histidina

4 0.610 0.273 Metionina

3 0.610 0.369 Glutamato

2 0.818 0.534 Tirosina

1 0.858 0.657 Fenilalanina

DISCUSIÓN

Entre más polar sea un aminoácido, más fuertemente se adsorbe en la fase estacionaria (sílica gel), por lo que su migración a lo largo de ella es menor, y por tanto es arrastrado más lentamente por la fase móvil que los compuestos menos polares. De este modo, la separación selectiva de los componentes de una muestra, por cromatografía, se debe a las diferencias en la migración de los componentes individuales a lo largo de la fase estacionaria.

Así, los aminoácidos menos polares se unen (adsorben) con menos fuerza al adsorbente (fase estacionaria) que los más polares, por lo tanto, se mueven más rápidamente cuando la mezcla se eluye con algún disolvente (fase móvil). Por lo tanto, los disolventes polares moverán los componentes de la mezcla más rápidamente que los disolventes menos polares. (2)

Todos los cromatogramas fueron revelados con ninhidrina al 0.2% en etanol al 96%, la ninhidrina reacciona con los aminoácidos que tengan su grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, y la ninhidrina se reduce a hidrindantina, ésta última reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble, y lo observamos como manchas con una coloración azul-púrpura, a excepción del aminoácido prolina que presenta una coloración amarillenta ya que éste aminoácido no tiene grupo amino libre y por tanto no produce amonio al reaccionar con el revelador.

En base

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