Identificación de aminoácidos mediante cromatografía de capa fina

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Bioquímica

Informe de laboratorio

Práctica N. 6

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1. IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

Acho Orozco Brayan Giovanni^[1], Torres Marulanda Diego Fernando^[2], Fitatá Castaño Joan Sebastián^[3]

1. Resumen (summary).

La cromatografía en capa fina, es un método físico de identificación y separación de mezclas complejas. Su aplicación se extiende en distintas ramas de la ciencia y en medicina. Es una técnica basada en el principio de retención selectiva, donde se separan los distintos componentes de una mezcla. Permitiendo determinar las propiedades de la sustancia evaluada. Específicamente, la cromatografía en capa fina es la técnica más empleada. Comprende dos fases, la fase estacionaria consiste de un gel de celulosa, sílica, óxido de aluminio, etc. La separación se efectúa dado las distintas afinidades de adsorción de los componentes de la muestra hacia la superficie de la placa cromatográfica o fase estacionaria. La fuerza con la que es adsorbido un componente dependerá de la polaridad de los componentes, de la actividad del adsorbente que conforma la fase estacionaria y de la polaridad de la fase móvil. El objetivo de esta práctica fue realizar el aislamiento de distintos aminoácidos puros frente a una muestra proteica. Los resultados fueron positivos, encontrando valores para cada aminoácido respecto a los valores teóricos esperados. Adicionalmente una revelación con ninhidrina permitió ver el desplazamiento de las muestras. Las diferentes longitudes de onda evidenciaron el movimiento de las muestras. Esta técnica demuestra ser efectiva, de fácil aplicación y gran importancia en el campo de la salud. Ya que uno de sus usos en bioquímica clínica es determinar aminoácidos o metabolitos de importancia medicinal y farmacéutica.

Thin layer chromatography is a physical method of identification and separation of complex mixtures. Its application extends to different branches of science and medicine. It is a technique based on the principle of selective retention, where the different components of a mixture are separated. Allowing to determine the properties of the evaluated substance. Specifically, thin layer chromatography is the most widely used technique. It comprises two phases, the stationary phase consists of a gel of cellulose, silica, aluminum oxide, etc. The separation is carried out given the different adsorption affinities of the sample components towards the surface of the chromatographic plate or stationary phase. The strength with which a component is adsorbed will depend on the polarity of the components, the activity of the adsorbent that makes up the stationary phase, and the polarity of the mobile phase. The objective of this practice was to isolate different pure amino acids from a protein sample. The results were positive, finding values ​​for each amino acid with respect to the expected theoretical values. Additionally, a revelation with ninhydrin allowed us to see the displacement of the samples. The different wavelengths evidenced the movement of the samples. This technique proves to be effective, easy to apply and of great importance in the field of health. Since one of its uses in clinical biochemistry is to determine amino acids or metabolites of medicinal and pharmaceutical importance.

1. Palabras clave (keywords).

Cromatografía, identificación, medicina, polaridad, farmacéutica.

Chromatography, identification, medicine, polarity, pharmaceutical.

1. Objetivos.

• Separar e identificar los aminoácidos presentes en una muestra problema mediante el uso de cromatografía en placa fina y/o papel.

• Caracterizar los productos obtenidos mediante la cromatografía.

1. Marco teórico.

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Figura 1. Mapa conceptual sobre los aspectos relevantes de la cromatografía y cromatografía en capa fina.

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Figura 2. Diagramas de flujo del procedimiento en laboratorio

1. Resultados.

1. Mediciones

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Figura 3. Desplazamiento en cámara cromatográfica. De izquierda a derecha los puntos señalados corresponden a los aminoácidos a) Alanina, b) Fenilalanina, c) Arginina y d) Muestra problema (suplemento dietario Ensure).  

Hay una relación directamente proporcional entre la polaridad y el orden de elusión, teóricamente la Figura 4 representa la forma correcta de interpretar los resultados. Esta relación es medible a través del factor de retención (Figura. 4). Donde a distancia recorrida por la sustancia es dividida por la distancia recorrida por el eluyente.

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Figura 4. Relación esperada para el factor de retención en función de la polaridad. Aquellos aminoácidos más polares tendrán un mayor factor de retención. La unidad de medida para esta ecuación es en centímetros.

Generalmente la placa cromatográfica posee una menor polaridad que la solución, por este sencillo hecho, las muestras evaluadas que tengas una mayor polaridad o afinidad con el eluyente, permanecerán más cerca de la base. Mientras que las soluciones menos polares, estarán más alejadas de la solución y ascenderán por la placa cromatográfica.

Teniendo en cuenta la relación de longitud recorrida por las muestras fijadas en la placa cromatográfica se determinó su factor de retención (Rf) (Tabla. 1). Donde se obtuvo un resultado coherente con las aproximaciones teóricas. Ya que, la alanina (Rf: 0,33) y fenilalanina (Rf:0,31) se encuentran dentro de los aminoácidos pertenecientes al grupo 1, con características hidrofóbicas. Esto implica un determinado coeficiente de repelencia de las sustancias polares (Carey, 2002).

Los aminoácidos de este grupo poseen grupos alifáticos o aromáticos y, por consiguiente, son hidrofóbicos. Dado que estas cadenas son en su mayoría hidrocarbonadas (Figura. 5), su reactividad química es menor. Debido a su conformación en medio acuoso, las proteínas disueltas se pliegan en forma tridimensional que oculta en su interior los residuos hidrofóbicos de los aminoácidos de este grupo (Carey, 2002).  Respecto a la arginina (Rf: 0,47), fue el aminoácido con un mayor factor de retención.

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