Cromatografía De Capa Fina

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

Adquirir el conocimiento teórico de algunos aspectos relacionados con la cromatografía.

Saber las diferencias entre algunas técnicas utilizadas en el análisis cromatográfico.

Lograr separar una mezcla de colorantes por cromatografía de capa fina.

CUESTIONARIO

¿Qué sucede si al introducir la placa en la cámara cromatográfica, el nivel del eluyente alcanza el sitio de aplicación de la mancha?

Lo más posible es que parte de la siembra que está en la en la placa se diluya por todo el eluyente, lo que puede causar que se mezclen las siembras y no se identifiquen unas de las otras, alterando así el resultado y la práctica.

¿Cuál es el efecto de la polaridad en la cromatografía?

La mayor o menor velocidad de desplazamiento a lo largo de la columna depende directamente de la estructura de cada molécula, así como de los grupos funcionales que pueda poseer. El motivo principal es su diferencia de polaridad. Las moléculas más polares quedan más retenidas en la fase estacionaria, es decir “corren menos” cuando el eluyente es de polaridades bajas. Mientras que las moléculas menos polares se ven menos retenidas y avanzan a mayor velocidad arrastradas por el eluyente de polaridad baja. Es decir, entre más semejante sea la polaridad del sorbente-eluyente, mayor será la velocidad.

¿Cuáles son las consecuencias de una columna mal empacada?

Una columna mal empacada puede crear sitios en los que el eluyente pueda moverse con mayor facilidad o menos, lo cual ocasiona una velocidad variable del eluyente-sorbente y causar así errores en la lectura.

Profundización sobre fluorescencia para sustancias incoloras

Es así, hay varios métodos para visualizar las manchas correspondientes a cada componente de la mezcla.

Utilizar luz ultravioleta (UV254) para observar la placa. Normalmente se adiciona un colorante fluorescente al adsorbente, de forma que la placa sea fluorescente en todas partes excepto donde haya una mancha correspondiente a un compuesto orgánico.

Parámetros de la cromatografía liquida de alta eficiencia.

Diámetro interno

El diámetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. Las columnas de diámetro interno más grande (>10mm) se utilizan normalmente en la purificación de compuestos para su utilización posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analítico y normalmente están asociadas a un detector de UV-VIS. Aparte, existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un diámetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometría de masas.

Medida de las partículas

La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de sílice. Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5\mum de diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación, pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. Esto significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad, aumentaría la resolución de la columna, pero a la vez, aumentaría la presión necesaria en un factor de ocho.

Tamaño de poro

Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros pequeños proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan una cinética mejor, especialmente para los compuestos de tamaño más grande; por ejemplo, una proteína que sea ligeramente más pequeña que el tamaño de los poros puede entrar, pero difícilmente saldrá con facilidad.

Presión del sistema

La presión de las bombas es variable según el modelo y fabricante, pero su rendimiento se mide en su habilidad para generar un flujo constante y reproducible. La presión puede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmósferas). Los aparatos más modernos de HPLC incorporan mejoras para poder trabajar a presiones más altas y, por lo tanto, poder utilizar partículas de tamaño más pequeño en las columnas (< 2 micrómetros). Estos nuevos aparatos, denominados ultra performance liquid chromatography (UPLC) pueden trabajar con valores de hasta 100 MPa de presión (unas 1000 atmósferas). (Hay que tener en cuenta que las siglas UPLC son una marca registrada de Waters Corporation aunque a veces se utilizan de forma general para designar este tipo de aparatos).

PATRONES

O-Nitrofenol:

Imagen 1. Estructura del O-NItrofenol

Es un compuesto derivado de un anillo bencénico, el grupo hidroxilo le confiere propiedades similares a las de un fenol, esto se ve reflejado en su solubilidad ya que es baja, puesto que el anillo bencénico tiene una estructura netamente apolar, y el grupo nitro unido a una estructura aromática se considera apolar, por esto se ve explicada su baja solubilidad y polaridad.

M-Nitroanilina:

Imagen 2. Estructura de la M-Nitroanilina.

Como ya se ha mencionado anteriormente el grupo nitro unido a un anillo aromático es apolar, con el grupo amino se ve reducido su carácter polar, este comparado con el del grupo hidroxilo es mucho menor, por lo tanto su solubilidad en agua es menor que la del o-nitrofenol.

Azobenceno:

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