Separación E Identificación De Aminoácidos De Jugos De Frutos Por Cromatografía Bidimensional En Capa Fina.

Objetivos personales.

Hacer una análisis cualitativo de los aminoácidos presentes en el jugo de naranja utilizando la técnica de cromatografía en placa fina bidimensional

Comparar el método de cromatografía en placa fina bidimensional con el de cromatografía en capa fina usando una sola fase móvil.

Fundamento de la técnica.

La cromatografía en capa delgada (TLC, thin-layer chromatography) es un ejemplo especial de cromatografía de adsorción donde la fase estacionaria es un plano en la forma de un sólido soportado sobre una placa inerte, y la fase móvil es un líquido.(1)

El disolvente asciende por la placa por capilaridad y los componentes de la muestra suben a través de la fase estacionaria depositada en la placa a diferentes velocidades que dependen de su solubilidad y de su grado de retención por la fase estacionaria.

El fundamento de la separación es la adsorción, fenómeno fisicoquímico de superficie que se característica por la acumulación de un determinado compuesto en la interfase de un sistema binomial. En el caso de al cromatografía, se presenta una adsorción física, la cual está regida principalmente por interacciones débiles, específicamente interacciones de Van der Waals.

La fase estacionaria es generalmente un polvo finamente dividido con el cuál se prepara una suspensión acuosa utilizando un aglomerante, como yeso o alcohol polivinílico, para ayudar a que se adhiera al material de soporte. La suspensión de extiende sobre la placa en forma de una capa muy delgada (0.1 a 0.3mm), para lo cual se utiliza un repartidor adaptador para asegurar que el espesor sea uniforme. Posteriormente se evapora el disolvente y se activan los adsorbentes colocándolos en una estufa a 110°C durante varias horas.

La sílice gel es una de las fases estacionarias más utilizadas, en especial cuando se usan disolventes polares (alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos). Las partículas de gel de sílice contienen grupos hidroxilo en su superficie que forman interacciones intermoleculares de tipo dipolo ‐ dipolo o enlaces por puente de hidrógeno entre el soluto y el adsorbente (figura 1). El agua adsorbida evita que otras moléculas polares lleguen a la superficie, por lo que es necesario activar el gel por medio de calentamiento para eliminar el agua adosrbida. Se pueden usar como adsorbentes silicato de magnesio, silicato de calcio, entre otros.(2)

La superficie de sílice tiene hasta 8μmoles de grupos silanol (Si-OH) por metro cuadrado. Todos los grupos silanol están prácticamente protonados si el pH es de 2 a 3. Se disocian formando Si-O- en un amplio intervalo de pH por encima de 3. Estos grupos con carga retienen fuertemente las bases protonadas y originan colas. (3)

Por esta razón se realiza la neutralización con vapores de hidróxido de amonio, ya que las cargas de la sílice podrían interferir en el proceso de elución, y lo que se busca es que sea únicamente el fenómeno de adsorción el que participe.

Resultados experimentales.

Representación esquemática de los cromatogramas.

Se realizaron las cromatografías unidimensionales utilizando 10 soluciones de aminoácidos tipo, de las cuales se agregó 1μL de cada una, mas el problemas que fue jugo de naranja de la cual se agregaron 3 μL. La fotografías de las placas se anexaron a continuación

Figura 1. Fotografía de la placa 1. Cromatografía unidimensional de aminoácidos tipo mas problema con la 1ª fase móvil (cloroformo-metanol-amoniaco)

Figura 2. Fotografía de la placa 2. Cromatografía unidimensional de aminoácidos tipo mas problema con la 2ª fase móvil (butanol-ácido acético-agua).

Figura 3. Fotografía de la placa 3. Cromatografía bidimensional de aminoácidos tipo.

Figura 4. Fotografía de la placa 4. Cromatografía bidimensional de la muestra problema (jugo de Naranja).

Cálculo de Rf’s.

Para realizar el cálculo de los Rf´s se utilizo la formula:

R_f=(Frente o distancia del soluto)/(Frente o distancia del disolvente)

Los resultados para las soluciones de aminoácidos tipo se anexan en la tabla 1.

Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollado en las dos fases móviles

Aminoácido 1a. Fase móvil 2a. Fase móvil

Frente del soluto Frente del disolvente Rf Frente del soluto Frente del disolvente Rf

Arg 2.2 7.7 0.28571429 1.1 7.7 0.14285714

Lys 3.9 7.8 0.5 0.9 7.8 0.11538462

Pro 5.4 7.8 0.69230769 2.1 7.7 0.27272727

Gly 6.2 7.8 0.79487179 2.2 7.8 0.28205128

His 7 7.8 0.8974359 1 7.9 0.12658228

Thr 6.8 7.7 0.88311688 2.5 7.7 0.32467532

Glu 6.8 7.8 0.87179487 2.8 7.85 0.3566879

Tyr 7.2 7.8 0.92307692 4.45 7.8 0.57051282

Met 7.5 7.8 0.96153846 4.3 7.8 0.55128205

Phe 7.65 7.9 0.96835443 4.9 7.8 0.62820513

Table 1

Los resultados de cálculos de Rf de la la muestra problema que coincidieron con los de los aminoácidos tipo se comparan en la tabla 2.

Mancha Rf

1 0.06329114

2 0.28481013

3 0.46835443

4 0.56962025

5 0.65822785

6 0.79746835

7 0.93670886

8 0.97468354

9 0.96835443

Aminoacido

tipo Comparación con el jugo (1a fase móvil) 2a. Fase móvil

Rf's de los aminoacidos tipo No. de mancha Rf´s de las manchas Rf's de los aminoacidos tipo No. de mancha Rf´s de las manchas

Arg 0.28571429 2 0.28481013 0.14285714 1 0.1025641

Lys 0.5 3 0.46835443 0.11538462

Pro 0.69230769 5 0.65822785 0.27272727 2 0.23076923

Gly 0.79487179 6 0.79746835 0.28205128 3 0.28205128

His 0.8974359 0.12658228

Thr 0.88311688 0.32467532 4 0.33974359

Glu 0.87179487 0.3566879

Tyr 0.92307692 7 0.93670886 0.57051282

Met 0.96153846 9 0.96835443 0.55128205

Phe 0.96835443 8 0.97468354 0.62820513 5 0.6025641

Table 2

De acuerdo con las comparaciones se identifican los aminoácidos Arg, Lys, Pro, Gly, Tyr, Met, Phe con la primera fase móvil. Se encontraron otras dos manchas cuyos valores de Rf no coinciden con ninguno de los aminoácidos trabajados en el laboratorio en soluciones tipo, por lo que pueden ser de otros aminoácidos.

En la segunda fase móvil se identificaron los aminacidos: Arg, Pro, Gly, Thr, Phe. En este caso no hubo más

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