Curva de calibración para p-nitrofenol

Materiales y Método

A.- Experiencia 1: Curva de calibración para p-nitrofenol

Materiales

• Espectrofotómetro

• 60 µM p-nitrofenol en 20 mM NaOH

• 20 mM NaOH

• 6 tubos de ensayo

• 1 cubeta de espectrofotometría

• Marcador de vidrio

• Una gradilla

• Micropipeta de 1000 µl

Método experimental

1. Reunir todos los materiales.

2. Enumerar los tubos de ensayo del 1 al 6.

3. Ayudados por la micropipeta de 1000 µl agregar a los tubos enumerados del 1 al 6, 0, 1, 2, 3, 4 y 5 ml respectivamente, de una solución de 60 µM p-nitrofenol en 20 mM NaOH.

4. Con ayuda de la micropipeta de 1000 µl completar cada tubo con una solución de NaOH 20 mM hasta alcanzar un volumen final de 5 ml.

5. Con la solución contenida en el tubo 1 blanquear el espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm.

6. Medir en el espectrofotómetro, a una longitud de onda de 405 nm, la absorbancia (A) de todas las soluciones.

7. Con los datos obtenidos, confeccionar una curva de calibración para absorbancia.

B.- Experiencia 2: Curva de progreso y búsqueda de una dilución adecuada de enzima

Materiales

• Baño termorregulado

• Espectrofotómetro

• 100 mM tampón citrato (pH 4.8)

• 0.1% seroalbúmina de bovino (BSA) en tampón citrato 100 mM (pH 4.8)

• 2.5 mM p-nitrofenil fosfato disódico (pH 4.8) (mantener a 4⁰ C)

• 100 mM NaOH

• Extracto crudo de fosfatasa ácida de gérmen de trigo (1 mg/ml)

• 20 tubos de ensayo

• 2 cubetas de espectrofotometría

• Marcador de vidrio

• Una gradilla

• Micropipeta de 200 µl y de 1000 µl

• Cronómetro

Método experimental

1. Reunir todos los materiales.

2. Marcar dos tubos de ensayo con 1:10 y 1:100.

3. Para el tubo de 1:10, con ayuda de la micropipeta de 1000 µl agregar 0.5 ml de la solución stock de enzima (1 mg/ml).

4. Al mismo tubo, añadir 4.5 ml de solución BSA al 0.1%, de esta manera obtendremos una dilución 1:10 del extracto enzimático (0.1 mg/ml).

5. Con la micropipeta de 1000 µl, al tubo marcado con 1:100 añadir 0.5 ml de la dilución enzimática preparada anteriormente.

6. Al paso anterior adicionar además, 4.5 ml de solución BSA al 0.1%, de esta manera obtendremos una dilución enzimática de 1:100 (0.01 mg/ml).

7. Enumerar 3 tubos del I al III.

8. Ayudados por la micropipeta de 1000 µl, preparar estos tubos, agregando a cada uno 2 ml de tampón citrato 0.1 M y 2 ml de 2.5 mM p-nitrofenil fosfato disódico.

9. Incubar, los tubos enumerados del I al III, en un baño termorregulado a 37⁰ C por dos minutos.

10. Pasado el tiempo indicado, agregar a los tubos I, II y III, las diluciones enzimáticas preparadas anteriormente, de la siguiente manera:

- Tubo I: 1 ml de solución sin diluir (1 mg/ml)

- Tubo II: 1 ml de dilución 1:10 (0.1 mg/ml)

- Tubo III: 1 ml de dilución 1:100 (0.01 mg/ml)

Mezclar. De esta manera se da inicio a la reacción.

11. Disponer de 3 tubos de ensayo enumerados del IV al VI.

12. Agregar a los tubos IV, V y VI, 4.5 ml de NaOH 0.1 M.

13. Utilizando una micropipeta tomar alícuotas de 0.5 ml de los tubos enumerados del I al III y adicionarlas a los tubos IV, V y VI respectivamente, de esta manera detendremos las reacciones enzimáticas llevando el medio a un pH alcalino.

14. Enumerar 12 tubos de ensayo con los tiempos (t) 10, 20, 30 y 40, para los medios de reacción IV, V y VI.

15. Usando la micropipeta de 1000 µl adicionar a los tubos enumerados anteriormente, 4.5 ml de NaOH 0.1 M.

16. Luego de 10 minutos de iniciada la reacción tomar una alícuota de 0.5 ml de cada medio reacción y transferirlas a su respectivo tubo marcado en t = 10.

17. Repetir el paso anterior con los tubos t = 20, t = 30 y t = 40, tras 20, 30 y 40 minutos de iniciada la reacción.

18. Utilizando el tubo 0 de la experiencia anterior (es decir, aquel que no contiene extracto enzimático), blanquear a 0 el espectrofotómetro.

19. Medir la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm de los medios tras 10, 20, 30 y 40 minutos.

20. Con los datos obtenidos, y utilizando la curva de calibración confeccionada en la experiencia 1, determinar la cantidad de producto formado luego de 10, 20, 30 y 40 minutos de ensayo.

21. Graficar la cantidad de producto formado versus tiempo.

C.- Experiencia 3: Determinación de la constante de Michaelis para p-nitrofenilfosfato

Materiales

• Extracto crudo de fosfatasa ácida de gérmen de trigo (1 mg/ml)

• 100 mM tampón citrato (pH 4.8)

• 0.1% BSA en tampón citrato 100 mM (pH 4.8)

• 25 mM p-nitrofenil fosfato disódico (pH 4.8) (mantener a 4⁰ C)

• 2.5 mM p-nitrofenil fosfato disódico (pH 4.8) (mantener a 4⁰ C)

• 100 mM NaOH

• Baño termorregulado

• Espectrofotómetro

• 6 tubos de ensayo

• 2 cubetas de espectrofotometría

• Marcador de vidrio

• Una gradilla

• Micropipeta de 200 µl y de 1000 µl

• Cronómetro

Método experimental

1. Reunir todos los materiales.

2. Enumerar seis tubos de ensayo del I al VI.

3. Con ayuda de las micropipetas de 200 µl y de 1000 µl agregar a los tubos enumerados del I al VI, las siguientes cantidades de 25 mM p-nitrofenil fosfato disódico:

- Tubo I: 0 ml

- Tubo II: 0.05 ml

- Tubo III: 0.1 ml

- Tubo IV: 0.2 ml

- Tubo V: 0.5 ml

- Tubo VI: 1 ml

4. Con las micropipetas de 200 µl y de 1000 µl adicionar a cada tubo suficiente tampón citrato 0.1 M (pH 4.8) hasta completar un volumen de 4 ml.

5. Incubar los tubos en el baño termorregulado a 37⁰ C por cinco minutos.

6. Pasado el lapso de tiempo indicado, con la micropipeta de 1000 µl, añadir 1 ml de dilución de enzima a cada tubo y mezclar bien.

7. Dejar actuar por 20 minutos.

8. En el espectrofotómetro, con la solución contenida en el tubo I blanquear

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