EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA EN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS DEL SUERO SAGUINEO

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Universidad de Chile

Facultad de Ciencias

Escuela de Pregrado

QC771-1 Química Biológica

EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA EN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS DEL SUERO SAGUINEO: PRECIPITACION POR SALAZÓN Y EFECTO SOLUBILIZANTE DEL CLORURO DE SODIO.

José Enrione Miranda, Sebastián Silva Monroy

1. Introducción

Al tratarse multielectrolitos, la solubilidad de las proteínas, en solución acuosa, es dependiente de las concentraciones de las sales disueltas, análogamente a la de los electrolitos de solubilidad limitada, de manera que se observa:

• Un incremento de la solubilidad de las proteínas en solución salina, respecto a cuándo se disuelven en agua pura, cuando la fuerza iónica del medio (I) es baja. Esto se debe a que los iones disueltos estabilizan, por interacciones electroestáticas, a los grupos ionizados de las proteínas, y que se manifiesta a través de la disminución del coeficiente de actividad de las especies cargadas (γx), a medida que aumenta la fuerza iónica, tal como predice la teoría de Debye-Huckel, cuya ecuación expresa:

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expresión válida en solución acuosa, a 25ºC y si I < 0,1 M, en el que se evidencia, además, que el decrecimiento de γx, cuando aumenta I, es mayor mientras mayor sea la carga Zx de la especie y mientras menor sea su radio hidratado α.

• Una disminución de la solubilidad de las proteínas en solución salina, en contraste a cuando se disuelve en agua desionizada o destilada, a altos valores de fuerza iónica. Este fenómeno, se puede atribuir, a que cuando hay una elevada concentración de iones, éstos compiten con las proteínas por las mismas moléculas de agua que las solvatan completamente. En estas condiciones, las interacciones proteínas-proteínas se maximizan, y estas macromoléculas, precipitan. Aún cuando la ecuación expandida de la teoría de Debye-Huckel no pueda ser aplicable a valores elevados de fuerza iónica, la variación del coefiente de actividad, que ahora es creciente con el aumento de la fuerza iónica, sigue mostrando dependencia con el aumento en la carga y la disminución en el radio hidratado de la especie iónica, por lo que son las especies iónicas de mayor magnitud de carga y de menor radio hidratado, las que tienden a la precipitación temprana a medida que crece I.

Gracias a ambos comportamientos, es posible observar un efecto solubilizante en las proteínas que están en o cerca de su punto isoeléctrico, cuando se adiciona una sal de iones de carga monovalente y de altos radios hidratados, como el cloruro de sodio (NaCl); y un efecto precipitante, cuando se adiciona solución saturada de sal de iones de carga multivalente y de bajos radios hidratados, como el sulfato de amonio ((NH4)2SO4). Este último, es el principio que se basa la precipitación por salazón para separar proteínas desde un extracto, debido a que la concentración de sal que se requiere para que una proteína precipite, es característica de ésta a valores definidos de pH y temperatura, lo que sugiere que el efecto de la fuerza iónica no solo depende de la sal escogida ni del número de grupos ionizables que conste la proteína, sino también de la secuencia de los residuos de su estructura 1º, que es la define la forma de plegamiento a niveles estructurales superiores de la macromolécula, y que a su vez, es la que determina el entorno ambiental que afecta a cada grupo ionizado y la variación conformacional cuando cambia I.

En este práctico, se pretende utilizar el efecto precipitante del (NH4)2SO4 para separar las proteínas del suero sanguíneo, …..

2. Reactivos

• Solución de sulfato de sodio saturada a 37 [°C]
• Solución de NaCl 0,15 [M]
• Reactivo de Biuret (para 1 [L] disolver 1,5 [g] de CuSO4∙5H2O y 6 {g] de tartrato de Na+ y K+∙4H2O en 500 [mL] de agua. Agregar a esta solución 300 [mL] de NaOH 10%, enrasar a 1 [L]).
• Muestra de suero sanguíneo humano
• Solución estañar de ovoalbúmina 10mg/ml
• Solución de ácido acético 0,1N
• Solución de NaOH 0,1N
• Solución de NaCl 2M

3. Procedimiento Experimental

a) A distintas concentraciones  (entre  0,5 [mg] a 6 [mg]) de solución estándar  ovoalbúmina 10 [mg/mL], se agregó 4 [mL] de reactivo de Biuret, completando con NaCl 0,15[M] hasta   6 [mL]. Se Calento a 50 [°C] durante 5  minutos y se midio  la absorbancia a 540 [nm]. Generando la curva de calibración.

b) Se precipito seroglobulina de una alícuota de 0,5 [mL] de suero sanguíneo con solución de sulfato de amonio 6 [M] (completando 10 [mL]). Calentando por  15 minutos a 37 [°C]. Centrifugando para luego  extraer  y filtrar el  sobrenadante. Luego se cuantifico mediante método de Biuret.

 Luego las proteínas totales del suero se cuantifican por método de Biuret, utilizando 0,5[mL] de suero sanguíneo y 9,5 [mL] de solución de NaCl 0,15 [M].

c)  A 0,5 [mL] de suero sanguíneo en 49,5 [mL] de agua destilada,  se agregó  gota a gota ácido acético 0,1 [M], mezclando suavemente después de cada adición, observando la aparición de enturbiamiento y se  agrego mas acido acético 0,1 {M] hasta que desaparecio el enturbiamiento. Despues se adiciono  gota agota  NaOH 0,1 [N] hasta aparición de enturbiamiento. Se tituló  la mezcla con solución de NaCl 2 [M] hasta que desapareció el precipitado. Registrando el  volumen gastado de NaCl 2 [M].

4. Resultados

1. Curva de calibración

La tabla 1  recopila los datos  para construir una curva de calibración para el método de Biuret, que permitió extrapolar la concentración por la ley de Lambert-Beer (2).

Tabla 1.   Absorbancia medida a 540 [nm]  de soluciones de ovoalbúmina  estándar a distintas concentraciones.

Al  graficar la relación concentración de ovoalbúmina estándar con la absorbancia medida,  mediante el criterio de linealidad se determinó cual medida de absorbancia utilizar. La primera medida resulta tener un mayor coeficiente de determinación (R2= 0,99455) siendo elegida para realizar la curva de calibración.

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