Enzimas de restricción

1. ¿Qué es una enzima de restricción? ¿Cuál es su mecanismo de acción? ¿Cómo se nombran y clasifican? Dada la secuencia de ADN siguiente: …  (JUAN PABLO)

AGCTTTTTTAGCATGCGAATTCCCGCCAGGCCTGGCGTTATGCAATTCATGTACGCTTAAGGGCGCTCCAATACGTTAAGTACTTTTAAACGTGGCTCTGG... ¿Cuántos y cuáles serían los fragmentos que originaría si se corta con la restrictasa EcoRI? ¿Cuántos y cuáles serían los fragmentos que originaría si se corta con la restrictasa EcoRII? Cómo se vería un gel de agarosa después de una electroforesis, con el primer carril con patrón de tamaño molecular de 10 en 10 hasta 100, segundo carril el segmento intacto, tercer carril digerido con EcoRI, cuarto carril con EcoRII y quinto carril digerido con las dos enzimas. 

De varios ejemplos del empleo actual de las enzimas de restricción en las ciencias biomédicas.  

¿Qué es una enzima de restricción?

En 1960, Stewart Linny y Werner Arber obtuvieron evidencias de que la degradación y la metilación del DNA detectada en bacterias se debían a un fenómeno de defensa del hospedador en contra de los bacteriófagos. Descubrieron estas enzimas al estudiar cepas de E. coli y observar que ciertas enzimas metilaban al DNA en una secuencia específica y otras lo cortaban en la misma posición. Las enzimas con capacidad de corte se llaman enzimas de restricción y deben su nombre a que “restringen” la permanencia de un DNA “exógeno” (por lo general proveniente de los bacteriófagos) en la célula bacteriana que la expresa.

¿Cuál es su mecanismo de acción?

Las enzimas de restricción particularmente son endonucleasas que cortan los enlaces fosfodiéster del DNA en secuencias específicas denominadas sitios de restricción. Esta secuencia tiene una longitud de 4-8 pares de bases presentes en el interior de una molécula de DNA; por lo común es palindrómica. Una secuencia palindrómica es aquella que se lee de la misma manera en un sentido y en el otro.

Con el sistema Restricción/Metilación, el DNA bacteriano no se ve cortado por su propia enzima, ya que las bacterias metilan su DNA para diferenciarlo del DNA viral, lo que evita que se corte. Las metilasas de este sistema reconocen la secuencia específica en el DNA de la bacteria y transfieren grupos metilo a partir de S-adenosil metionina, lo que crea los patrones de modificación que le confieren protección en contra de las enzimas de restricción. La molécula de DNA invasora es cortada en sus enlaces fosfodiéster del sitio de restricción, ya que éste carece de los patrones de modificación dados por las metilasas.

Los cortes que se realizan en los sitios de restricción no son siempre iguales, pueden producir extremos cohesivos, al hacer cortes que produzcan extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla y que pueden unirse con secuencias sobresalientes complementarias. Otras enzimas producen extremos romos; cortes a la mitad de la secuencia blanco que no dejan extremos de cadena sencilla.

Extremos Cohesivos

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Extremos Romos

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¿Cómo se nombran y clasifican?

Por acuerdo internacional, la nomenclatura de las enzimas de restricción se basa en lo propuesto por Hamilton Smith y Daniel Nathans en 1973, la cual es asignada según su origen bacteriano y se define con base en las siguientes reglas:

1. El nombre de la enzima debe empezar con un acrónimo de tres letras cursivas; la primera letra corresponde a la primera letra del género de la bacteria de la cual fue aislada la enzima; las siguientes dos corresponden al nombre de la especie. Por ejemplo: las enzimas aisladas de Escherichia coli comienzan con el acrónimo Eco y las enzimas aisladas de Haemophilus influenzae son Hin.
2. La segunda regla consiste en agregar letras extra o un número de acuerdo con la cepa o el serotipo al cual corresponda la bacteria de origen. Por ejemplo: EcoR, aislada de la cepa “RY13” de E. coli.
3. Posteriormente, se añaden números romanos; estos van en secuencia de acuerdo a la cronología en que se aislaron de la misma especie o cepa. Por ejemplo, EcoR I, EcoR V.
4. Por último, se agrega una “R” si la enzima tiene actividad de restricción o una “M” si la enzima tiene actividad de metilasa, aunque esta regla por lo general se omite.

La clasificación de las enzimas de restricción es la siguiente:

Enzimas Tipo I:

El sistema R/M tipo I está compuesto por diferentes subunidades que funcionan como un complejo. Por lo general, son dos subunidades R, dos M y una de especificidad a la secuencia reconocida (S). La función M y R se realiza por una sola enzima. Requieren del ATP, SAM y Mg2+ para poder realizar el corte del DNA. Cuando estas enzimas se encuentran con su secuencia de reconocimiento no metilada o hemimetilada (metilada sólo en una de las cadenas) el complejo activa la función M y generalmente el producto de metilación es N6-metiladenina. a secuencia de reconocimiento es corta (6 a 7 pb) y está compuesta por dos regiones específicas separadas por un espacio de pb. La enzima se une a estas dos regiones, pero el corte del DNA se realiza a miles de pares de bases de distancia de estos sitios de unión; al parecer el sitio de corte está determinado de forma aleatoria.

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