Separación de fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa a partir de digestión de ADN Plasmídico pGLO con enzimas de restricción EcoRI y HindIII

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

División de Ciencias Naturales e Ingeniería

Laboratorio de Ingeniería Genética y Técnicas Moleculares

Octavo Trimestre

Equipo 4

Reporte experimental 2

Separación de fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa a partir de digestión de ADN Plasmídico pGLO con enzimas de restricción EcoRI y HindIII

Responsables:

Alejandra Carvajal Martínez

Manuel González Santiago

Adán Málaga Olin

Miguel Ángel Tomate Hernández

Licenciatura en Ingeniería Biológica

Académico: Dra. Andrea Sabido Ramos

Junio 13, 2019

1. INTRODUCCIÓN

Los plásmidos suelen ser conformaciones de ADN en forma circular presentes comúnmente en bacterias, los cuales están separados del ADN y se replican independientemente de ella; mientras el ADN se replica una sola vez, los plásmidos se reproducen en muchas copias idénticas, por lo que terminan siendo en mayor parte que el ADN huésped. Entre sus características principales, por lo general, tienen un pequeño número de genes, algunos cuentan con resistencia a antibióticos y es fácil aislarlos de bacterias de forma pura. (Green, D. 2018).

El pGLO es un plásmido utilizado como vector con 5,500 pares de bases utilizado en la biotecnología como marcador, ya que el gen GPF (Green Fluorescence Protein) proporciona florescencia al exponerlo a la luz ultravioleta, también se expresan diferentes genes como la Beta-Lactamasa, el cual es el resultado de la resistencia a la Ampicilina, así como el gen de la arabinosa.

El uso de enzimas de restricción es importante para trabajar con los plásmidos, con el objetivo de reconocer secuencias específicas de nucleótidos. El pGLO utiliza tres importantes enzimas llamadas EcoRI, HindIII y BamHI, las cuales cortan tipo extremo cohesivo. Figura 1. Es importante mencionar que una enzima de restricción tipo II o una endonucleasa de restricción es una proteína que fue aislada a partir de una bacteria la cual la utiliza como defensa ante virus bacteriofagos o infecciones víricas, estas enzimas se utilizan para realizar cortes sobre el ADN en zonas muy específicas sobre enlaces fosfodiéster de la doble cadena.

Las enzimas de restricción se nombran conforme el género y la especie de donde se aislaron utilizando tres primeras letras seguida de una letra de la cepa de la que se aisló y un número romano para identificar la variante. Existen 3 diferentes tipos de Enzimas de restricción que van de acuerdo con sus propiedades, el tipo II es el más estudiado y utilizado ya que en el sitio donde realiza el corte es de simetría palíndroma es decir que se puede leer la misma manera de 5´- 3´ que de 3´- 5´, este tipo de enzima reconocen una secuencia diana; es decir que siempre restringen en una misma zona de entre 4 a 6 nucleótidos, estas enzimas pueden generar cortes en los extremos cohesivo o romos (figura 1).

Figura 1. a) corte cohesivo b) corte romo

La electroforesis es una técnica para la separación de fragmentos de ADN según su tamaño, lo que permite ver que tan grandes son entre ellos, la migración de moléculas es debido a su carga eléctrica y la velocidad con la que se desplazan depende de su tamaño, la cual ocurre sobre una matriz porosa. Para la realización de la electroforesis es necesario el uso de una celda de electroforesis capilar, donde las muestras se cargan en pozos y se aplica una corriente de carga eléctrica para ser arrastradas a través de una matriz porosa; comúnmente conformada por gel de agarosa o poliacrilamida.

El principio de agregar cargas eléctricas es porque los fragmentos de ADN, ARN o proteínas cuentan con carga eléctrica negativa, por lo que se mueven al electrodo positivo, en donde los fragmentos pequeños cruzan el gel más rápido que los grandes. Estos fragmentos pueden distinguirse si se utiliza un marcador de carga para teñir, entonces los fragmentos se pueden ver como bandas a partir de una revelación según el marcador utilizado.

Una marca comercial de marcadores es el AXYGEN®, en particular el 1 kb DNA Ladder es un marcador ideal para la determinación del tamaño de ADN digerido. Este marcador está formulado para ejecutarse con precisión y proporcionar patrones de bandas nítidas. Para facilitar su uso, el marcador no requiere preparación adicional, que contienen colorante azul de bromofenol. El cual debe subministrarse a una concentración de 50 μg / 500 μL (0.1 μg / μL).

Por otro lado, marcadores utilizados son para la tinción de bandas son bromuro de etidio, sin embargo es un marcador con alta mutagenicidad, por lo que se ha desarrollado uno seguro, que reduce este problema y puede teñir las bandas y, por tanto, detectar las de ADN teñidas, llamado SYBR ™ Safe DNA, que es capaz de detectarse usando un transiluminador UV estándar, un transiluminador de luz visible o un escáner basado en láser.

2. OBJETIVO

2.1 General

Aplicar la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar fragmentos de ADN plásmidico pGLO.

2.2 Objetivos Particulares

● Realizar digestiones sencillas y dobles mediante enzimas de restricción EcoRI y HindIII.

● Analizar los fragmentos productos de la digestión a partir de la separación en electroforesis en gel.

● Describir los principios básicos de la electroforesis en gel de agarosa.

3. MATERIALES

Reactivos

• Muestra de ADN plasmídico pGLO

• Amortiguador 10x

• Enzimas EcoRI e HindIII

• BSA (10mg/mL)

• Marcador de ADN

• Hielo

• Agua Milli-QTM

• Agarosa grado biología molecular

• TBE 6X

• Amortiguador de carga 5x

• SYBR® GREEN 10,000x

Materiales

• Espátula

• 500 mL de agua Milli-Q

• Matraz Erlenmeyer 200 ó 250 mL

• Cámara de electroforesis completa (charolas y peines)r

• Kit de micropipetas

• Gradilla para tubos eppendorf

• Alicuota de Buffer TBE Stock

• Parafilm

• Charola para pesar

• Probeta 50 mL

• Probeta 500 mL

• Vaso de precipitado de 500 mL

• Guantes

• Cloro

• Papel aluminio

• Contenedor para desechos de puntas

• Un tupper para almacenamiento del gel

• Cinta adhesiva gruesa

4. METODOLOGÍA

4.1 Cálculos previos a la preparación de muestras

...